20220821-非雷帕霉素结构的mTORC1选择性抑制剂

新用户0641yy4L 2022-09-10 发布于河南

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当前mTORC1的选择性抑制剂，已上市的只有雷帕霉素类的结构，属于变构抑制剂，前几日整理时看到针对该靶点的非雷帕霉素类变构抑制剂，比较感兴趣，今日整理较早的一篇JMC文章，描述一类该骨架分子。

文章利用多种虚拟筛选软件，结合已有数据库，初步筛选3000（65万个中）个Docking评分较高的分子；换软件评价筛选得到3个，分析成药性再伸入评估，得到骨架分子1个；之后对这个骨架分子中1个基团进行SAR，筛选过程结合软件分析和细胞数据，最终确定1个分子发文章。

提示：

CADD仍然是辅助设计，实际靠细胞实验，为了验证CADD结果，加入对蛋白多个位点点突变，验证Docking的对接位点，实验量较大；

该分子安全性较好，对正常细胞的毒性弱于肿瘤细胞100-1000倍，雷帕霉素是10倍；

思考及疑问：

1）变构抑制剂活性不如正构位点抑制剂，后者同时抑制2个复合物活性，且达到亚nM级别；

2）mTORC1底物S6K和eIF4E，对雷帕霉素的敏感性差异极大，是否与4EBP有关？

3）该分子是否能按雷帕霉素的思路，开发第三代mTOR抑制剂？

本文具体内容：

在体内营养物质、能量水平、生长因子的刺激下，mTORC1通过调节真核细胞转录因子（eIF4E）磷酸化以及S6K1磷酸化发挥调控蛋白质合成的功能；mTORC2通过调节AKT、PKC、SGK的磷酸化过程，控制细胞存活、细胞周期、细胞骨架的活动。

雷帕霉素通过与FKBP12蛋白结合，形成复合物后，再与mTOR蛋白以及其他蛋白结合，共同形成多个亚基组成的mTORC1蛋白，由于雷帕霉素的加入，导致蛋白支架变化：FRB招募S6K1结合在催化区域，但由于FKBP12-雷帕霉素复合物存在，抑制招募过程，导致变构抑制mTORC1的催化功能。在mTORC2复合物中，FKBP12亚基的区别，导致雷帕霉素不能结合在mTORC2中，因此雷帕霉素只能变构抑制mTORC1功能。

目前开发的mTOR抑制剂如Torin1、Torin2均是结合mTOR的催化位点，因此对2种复合物均有抑制活性。临床上雷帕霉素长期应用导致mTORC2功能激活；正构位点抑制剂导致耐药；PI3K&mTOR抑制剂导致On target副作用。本文介绍一种不同于雷帕霉素的mTORC1变构位点小分子抑制剂。

在雷帕霉素-FKBP12-FRB蛋白晶体复合物的基础上，利用软件分析对接关系，并得到一系列化合物，利用荧光标记的细胞活性评价筛选先导结构得到13，即WRX606。

在ZINC15数据库中利用3个数据库共659417个配体分子进行筛选，通过IC-PRO进行Docking评价，使用的晶体复合物是FKBP-雷帕霉素-FRB晶体（PDB: 1FAP）。活性口袋是FKBP12与FRB接触表面、雷帕霉素周围的氨基酸残基，通过优化原子间氢键、配体的异构体间互相变化、删除水分子，最终得到每个配体库中打分前1000的Hits。其中第三个数据库（MW. > 500 Da）中的评分结果较好，打分前三的分子是下图C/D/E。选择这些分子用Pan Assay Interference Compounds（PAINS）筛选，评价理化性质和成药性，结果较接近。

对细胞转染后测试细胞活性：对HEK293细胞转染FKBP12-SmBiT和FRB-LgBiT质粒，测试3个小分子在1 μM活性对细胞的影响，发现FKBP12和FRB不直接作用，而是通过小分子形成三聚体复合物，其中WRX606诱导三聚体复合物形成的能力最强。

Docking结果分析，3个分子与蛋白作用方式不同，WRX606的喹唑啉和丁酰胺部分与FKBP12的D37、I56、Y82形成3根氢键，同时苯丙二茂、间位氯苯基暴露于疏水区域，形成下图H的U型构象。WRX513仅与I56形成1根氢键、WRX939仅与E54、I56，以及Y82的侧链形成氢键，结合能力较606较弱（缺少与D37的氢键），此外413的活性较弱，可能与分子量较小有关，不能完全占据位点，导致不能完全变构抑制FKBP12-FRB的结合/功能。

通过虚拟筛选确定WRX606作为基本骨架后，进行构效关系修饰：针对苄胺基团（红色部分），利用软件设计下图A的一系列结构，通过NanoBiT程序分析WRX601活性优异，通过实际细胞实验，活性弱于WRX606。且进一步确定活性降低一倍（C图）。

Docking结果显示WRX601的2甲基苯基接近FRB亚基表面，但形成的疏水作用较WRX606的3-氯苯基较弱。该基团处于FRB亚基表面，由S2035、W2101、Y2104、Y2105组成的口袋，WRX606能够伸入其中，但WRX601的2-甲基苯基的方向偏移，不能与Y2104作用，导致构象变化，并失去与D37的氢键作用，提示构象上微小的变化（RMSD = 0.82 Å）导致活性差异。

在QwikMD plugin程序中，仅FKBP12-FRB复合物存在时，FKBP12很容易从复合物中离去，验证复合物的形成需要配体。对照下雷帕霉素能够稳定三元复合物。对比939/513/606的计算结果，前二者与2个亚基形成的结果，构象变化较大，提示复合物不稳定，RMSD分别是1.65±0.59和3.18±0.97 Å，606形成的复合物与雷帕霉素相似，RMSD仅1.39±0.25 Å。

为验证Docking结果，将FKBP12，得到D37A、I56A、Y82A的亚型；作为阴性对照，制备了K73A的亚型（在结合位点较远处）。同时制备了S2035A、Y2038A、F2039A、T2098A、W2101A、Y2104A、Y2105A的FRB点突变亚型；同时E2051A作为阴性对照。下图A-C分别是雷帕霉素、606和601的Docking对接结果显示的作用位点；D-F是对接口袋的氨基酸分布位点，G是点突变的活性结果。

对比D37A和Y2038A、Y2104A的结果，发现对601的影响比606小，印证3-氯苯基位置在Y2104所处的口袋（与上图B/C结果一致）；FRB的F2039A和W2101A突变显著降低三者活性，提示对于配体结合的重要性，晶体结构也显示F2039和W2101与雷帕霉素的疏水部分形成疏水作用；在606和601结构中，与苯胺和苯丙二茂结构形成疏水作用。FKBP12的D37与606形成氢键作用，与601没有形成氢键作用，导致D37A突变的活性差异。