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目前的研究认为，慢性乙肝病毒感染之所以能够持续存在，主要是因为缺乏有效的针对稳定HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)微染色体的新型治疗方法。法国里昂癌症研究中心(Cancer Research Center of Lyon，CRCL)研究人员进行了一项采用CRISPR/Cas9方法来靶向HBV基因组的研究，并研究了CRISPR/Cas9基因编辑后cccDNA的走向。 研究人员首先在表达HBV受体钠离子牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）的HepG2细胞中建立了一种核糖核蛋白(RNP)递送系统。其次，在建立感染后将核糖核蛋白(RNP)复合体进行递送，旨在确保cccDNA的靶向性。最后，在进行CRISPR/Cas9基因编辑后研究人员对细胞内外HBV参数进行分析。使用Southern印迹分析确定 cccDNA的表达，使用RNA测序以确定突变的cccDNA是否具有转录活性。 研究结果显示，通过对不同的HBV特异性gRNA的筛查发现，无论是单一的还是组合的，都表明CRISPR/Cas9可以有效地影响HBV的复制。根据HBV基因组中的靶点，CRISPR/CAS9 可使总 HBV DNA 降低或发生突变，两者都导致病毒转录本的减少。 除了cccDNA数量出现轻微减少，这种减少可能是由于降解的原因导致，研究人员持续观察到一个较小的 ccccDNA 片段的出现，通过PCR，Southern blot 和 RNA-seq 分析表明该片段在转录上是具有活性的。 这项研究结果表明，这个“小cccDNA”是Cas9同时在两个靶位点诱导双链断裂，然后修复大片段时产生的产物。 通过核苷类似物(NAs)抑制 HBV DNA 复制的中间产物后，加入核糖核蛋白(RNP)复合体出现了cccDNA水平降低，这表明cccDNA确实是 CRISPR/Cas9复合物的直接靶点。 综上所述，该项研究结果提示，用CRISPR/Cas9靶向乙型肝炎病毒会导致 cccDNA 的突变、裂解和修复，并且核苷类似物(NAs)和CRISPR/Cas9基因编辑两者合用具有有效的协同作用。 值得注意的是，Cas9诱导的效应是可持续的，表明乙肝病毒基因组发生了永久性的变化。 注：转载原创文章请务必注明“来源：肝脏时间（HeparSpace） 微信公众号”，否则小心作者追到你家门口(⊙o⊙)哦！ |
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