【原】一个转录开关调控心脏疾病中成纤维细胞的激活

健明 2022-09-23 发布于广东

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文章信息

文章题目:A transcriptional switch governs fibroblastactivation in heart disease
期刊：Nature
日期：2021/06/23
DOI：https:///10.1038/s41586-021-03674-1

摘要

成纤维细胞激活是组织中常见的应激反应，会使肺、肝、肾和心脏疾病恶化，但是具体机制不清楚。心脏成纤维细胞在静止和激活状态之间表现出强有力的切换，其方式与BET抑制剂暴露和心脏功能直接相关。本文主要工作：

利用对动态暴露于BET抑制剂的心脏的单细胞表观基因组分析，揭示了一个控制成纤维细胞激活的可逆转录开关。
scATAC-seq 数据分析发现新的DNA 元件，其中有调控MEOX1的增强子。MEOX1在活化的成纤维细胞中特异性表达，占据了部分纤维化基因的推定的调控元件，且是TGFβ诱导的fibroblast激活所必须的。

方法

全身施用BET抑制剂可以改善小鼠模型的心力衰竭。本文在间歇性BET主抑制剂暴露的情况下，对心脏组织进行单细胞转录组和表观基因组学分析。主要是用TAC方法制造心衰模型(TAC, transverse aortic constriction), 用JQ1(BET主抑制剂)治疗，取不同时间点的样本做scRNA-seq和scATAC-seq.

结果

1 成纤维细胞的转录可塑性

图1a 展示了4个实验组别。sham表示未处理正常鼠，剩下三组是TAC处理后的心衰小鼠。[TAC，心衰小鼠不处理；TAC JQ1是指JQ1处理的心衰小鼠；TAC JQ1 withdrawn是指JQ1处理后又戒断的心衰小鼠]。可以看到JQ1 withdrawn小鼠的左心室收缩功能又下降，表明JQ1(BET抑制剂)治疗的可逆性。

接着，作者用10X Genomics平台对四个实验组的35,000多个非心肌细胞进行了scRNA-seq(图1b)。细胞聚类图如(图1c)。在成纤维细胞中，TAC引起了细胞状态的巨大转变，而JQ1处理导致恢复到接近正常的状态（图1d）。戒断JQ1使成纤维细胞群回到类似TAC的受压状态（图1d）。动态的JQ1依赖性转录组转变也发生在内皮细胞和骨髓细胞区，但由JQ1引起的细胞状态不如在成纤维细胞中那样与正常组别的相似（图1d）。

接着对13,937个成纤维细胞转录组进行重聚类，更好地说明了在TAC状态下对JQ1的反应（图1e）。富含肌成纤维细胞的基因Postn10的表达，连同许多其他成纤维细胞激活的标志物，在TAC中被上调，在JQ1治疗时被下调，并在JQ1停用时重新出现（图1f）。因压力而上调的260个成纤维细胞相关基因对JQ1暴露高度敏感（图1g），并富集在胞外基质（ECM）、TGFβ信号和增殖相关（图1g）。JQ1停用导致左心室纤维化的增加（图1h）。这些都表明了成纤维细胞的转录可塑性。

Fig. 1: Heart failure reversibility with BET inhibition correlates with myofibroblast state.

2 成纤维细胞激活过程中的enhancers

为了分析心衰过程中JQ1在非心肌细胞中调节的染色质可及性和增强子激活的变化，做了个scATAC-seq. extended fig5a中，成纤维细胞在TAC后染色质可及性增加，JQ1处理后可逆地减弱，这一特征在髓细胞和内皮细胞中不太明显。

因为想找到动态且可逆的染色质变化（JQ1处理戒断后的可逆变化），排除了四种情况下都不变的情况，作者定义了远端的开放和关闭elements（extended fig5b）。发现cluster2在正常情况下、TAC JQ1两组中关闭，在TAC和TAC JQ1 withdrawn 两组中开放，分析显示这些基因富集与控制心脏生长和ECM组织的基因相近--这是不利于心脏重塑和纤维化的两个标志性特征。extended fig5c：在成纤维细胞里，正常组到TAC组的转变中，CEBPB、JUN和MEOX1转录因子的结合motif富集，TAC到 TAC JQ1后富集降低，JQ1 withdrawn 后又重新富集。

接着在体外培养的心脏成纤维细胞上进行PRO-seq（以碱基对分辨率绘制RNAP活性位点），确定了一组远端和基因元件，在TGFβ刺激后转录明显增多，并与成纤维细胞的激活有关（图2a）。结合scATAC-seq数据，体外TGFβ刺激的远端元件与心衰小鼠体内成纤维细胞中染色质开放的区域相关，而体内关闭的染色质区域则没有明显改变（图2b）。以Postn为例（图2c），在TAC之后，体内有染色质开放，对JQ1暴露有动态敏感性。peak 10/11 顺势元件是 TGFβ刺激后Postn transactivation所必须的（图2d）。

Fig. 2: Reversibility of chromatin states in fibroblasts reveals DNA elements that correlate with heart function.

3 染色质状态和心脏功能

为了识别参与心衰的进程与逆转的远端元件，研究者确定了一个超级增强子目录，并将这些增强子在成纤维细胞、骨髓细胞和内皮细胞中的可及性程度与所述每个治疗环境中的左心室射血分数相关联。图2e概括了增强子染色质可及性和生理特征（左心室射血分数）之间的相关性分析。如果增强子元素的可及性与心脏功能反相关（即从正常状态到TAC开放），则定义为负相关；如果从正常状态到TAC关闭，则定义为正相关。在确定的470个成纤维细胞超级增强器中，48个显示出强烈的负相关，而22个显示出强烈的正相关（图2f）。体内成纤维细胞中最负相关的元素之一是Meox1下游的一个大的增强子（图2f），暴露于JQ1后，Meox1的表达降低，而JQ1 withdrawn则导致其很强的高表达（图3a）。

Fig. 3: Chromatin accessibility and nascent transcription identify a cis-element controlling Meox1 expression.

4 压力诱导Meox1的顺式调控

Meox1下游的增强子对压力和JQ1暴露极为敏感，但在骨髓细胞和内皮细胞中不敏感（图3b）。来自成年小鼠左心室组织的公开的BRD4和H3K27ac ChIP-seq数据证实了Meox1基因座上这些活跃的增强子标记，表明该增强子可能调节Meox1（图3b）。PRO-seq确定了一个位于Meox1启动子下游62-65kb的区域（peak 9/10），该区域在TGFβ刺激后新生转录明显增加。CRISPRi敲除结果显示，peak 9/10顺式元件在TGFβ刺激下对Meox1的转录是特别需要的，而在体内发现的其他可接触区域则不是（图3c）。在TGFβ刺激下，peak 9/10的删除废除了Meox1的转录激活（图3d）。因此peak 9/10是转变为肌成纤维细胞过程中 Meox1的压力激活的enhancer。

5 MEOX1调节促纤维化功能

Meox1的耗竭削弱了TGFβ刺激的胶原蛋白凝胶收缩和EdU的结合，这是疾病发病机制中肌成纤维细胞的两个功能标志（图4a）。通过ChIP-seq在活性染色质（由H3K27ac标记）上的MEOX1占有率显示，在TGFβ处理后，MEOX1在应激反应远端元件的招募增加（图4b）。在Meox1被敲低后，TGFβ处理的成纤维细胞中由MEOX1结合的应激反应远端元件的转录减少（图4c）。在TGFβ刺激的情况下，Meox1敲低导致400多个基因与TGFβ单独相比下调，而863个基因的转录率更高（图4d）。对Meox1依赖性基因的GO分析再次显示了与成纤维细胞激活相关的过程的富集，如细胞迁移、运动和增殖的调节（图4d）。在这些基因中，包括Ctgf和Postn在内的心肌成纤维细胞激活的经典标志物，显示MEOX1在其启动子和近端调节元件（包括图2c，d中描述的Postn peak10/11增强子）上富集。这些元素在Meox1耗尽后也显示出转录减少（图4e）。因此，MEOX1作为成纤维细胞向肌成纤维细胞转换的一个重要转录媒介发挥作用。