|
2023年10月3日 理化研究所 名古屋大学 激活基因表达的超级增强子的再定义-鉴定疾病控制基因的新方法- 理化学研究所(理研)生命功能科学研究中心表观遗传控制研究小组(研究当时)的梅原崇史小组组长(研究当时，现创药蛋白质分析基础单元高级研究员)、南德斯研究员(研究当时)、 生命医科学研究中心表基因组技术研究小组(研究当时)的蓑田亚希子小组组长(研究当时，现radouboud大学副教授)、古关明彦副中心长(免疫器官形成研究小组组长)、名古屋大学研究生院医学系研究科肿瘤生物学教授近藤丰等共同研究小组， 通过以组蛋白[2]H4的高乙酰化[3]状态为指标重新定义强烈活化癌基因等表达的超级增强子，发现了与癌细胞干细胞[4]的控制相关的超级增强子。 在癌症等疾病细胞中可以看到特定基因的表达失控的状态，这被认为是与细胞增殖等相关的基因的控制区域形成超级增强子的原因之一。 到目前为止，超级增强子作为浓缩了在癌细胞中高表达的BRD4[5]等蛋白质、表基因组[6]的构成蛋白质组蛋白H3的第27个蓖麻毒素残基的乙酰化( H3K27ac )的表基因组的区域 此次，共同研究小组利用人的癌细胞株胶质母瘤细胞[4]，以组蛋白H4的第5个和第8个蓖麻毒素残基的乙酰化( H4K5acK8ac )为指标，开发了鉴定在癌症等疾病细胞中特异性发挥作用的基因的新方法。 本研究刊登在科学杂志《BMC Genomics》在线版( 9月27日)上。 背景我们的每一个细胞中含有的人类基因组DNA中存在约2万种基因。 这些基因不能同时发挥作用，而是有调节每个细胞决定的基因在何时何地表达的机制。 其中之一是由一种叫做组蛋白的蛋白质进行的调节。 组蛋白作为4种核心蛋白质( H2A、H2B、H3、H4 )各两个组合而成的8聚体存在，通过像枕一样缠绕DNA，将长的DNA收纳在核内(图1中为染色质[2]结构) 组蛋白受到乙酰化和甲基化[7]等修饰，改变染色质结构，调控着基因组DNA特定区域中基因的表达。 对组蛋白的化学修饰是可以撤消的(可逆的)，与对DNA的可逆化学修饰甲基化一起被称为“表观遗传控制”。 表观遗传学控制与个体一生中不变的DNA的碱基序列不同，是可逆地控制遗传信息的结构。 众所周知，组蛋白对H3和H4的乙酰化修饰在人类的表观遗传学调控中起着重要的作用。 特别是，在存在于H4的n末端侧的两个蓖麻毒素残基[8](K5和K8 )同时被乙酰化的高乙酰化状态( H4K5acK8ac )的组蛋白上，在癌细胞中高表达的BRD4等蛋白质结合，活化癌基因的表达(图1下)。  图1染色质结构与组蛋白高乙酰化 将由4种核心蛋白质( H2A、H2B、H3、H4 )各两个组合而成的8聚体上缠绕的DNA称为核小体，这是染色质的单位结构(上)。 各组蛋白受到乙酰化和甲基化等修饰，特别是存在于H4的n -末端的两个蓖麻毒素残基( K5和K8 )同时被乙酰化，称为高乙酰化状态( H4K5acK8ac ) (下)。 在特定细胞中表达特别多的基因具有在控制其表达的DNA区域具有多个被称为增强子[1]的序列的特征。 具有这种长调控序列的DNA区域被称为“超级增强子”，多见于对细胞分化和功能重要的基因附近，逐渐明白也与癌基因的活化有关。 由于认为超级增强子组蛋白多经化学修饰，因此在以往的研究中，超级增强子被发现是与乙酰化蓖麻毒素结合的蛋白质BRD4的定位、作为活化染色质指标的组蛋白H3的第27个蓖麻毒素残基的乙酰化( H3K27ac )等浓缩的基因组区域。但是最近有报告显示，H3K27ac并不一定是基因表达活化所必需的。 这意味着，通过传统方法找到的超级增强子可能包含不起作用的内容。 另一方面，与BRD4结合的H4K5acK8ac可以作为超级增强子的标记，但由于仅通过BRD4的定位无法特异性地检测出H4K5acK8ac，因此很难精密确定想调查的细胞的表基因组的哪里形成了超级增强子。 研究方法和成果联合研究小组在迄今为止的研究中，开发了在试管内再现组蛋白H4的各种乙酰化状态的技术，应用该技术开发了选择性识别H4K5acK8ac的单克隆抗体[9] (注1、2 )。 本研究使用该抗体、识别H3K27ac的抗体、识别BRD4的抗体等，使用作为难治性癌的胶质母瘤的细胞株，以精密确定在人胶质母瘤细胞的表基因组的哪里形成了超级增强子为目标。首先，使用上述抗体的染色质免疫沉淀碱基序列测定( ChIP-seq )法ChIP-seq对于在胶质瘤的干细胞株( GSC )、胶质瘤细胞株( U87 )、小胶质细胞株( C13 )中形成了什么样的组蛋白修饰模式 结果，检测到h4k 5a CK 8a-c的大多数表基因组区与h3k 27a-c、组蛋白H3的K4的三甲基化( H3K4me3)、BRD4的定位分别重叠，但与只检测到h4k 5a CK 8a-c的表基因组区、或 这种趋势在三种细胞株中都有出现。 此外，由于能够看到特定组蛋白修饰模式的表基因组区域的数量在细胞株之间存在很大差异，因此发现以H4K5acK8ac为代表的组蛋白修饰在表基因组中的位置在每个细胞株中存在很大差异。 图2胶质母瘤相关细胞中组蛋白H4高乙酰化和其他组蛋白修饰的分布 在胶质瘤干细胞株( GSC，左)、胶质瘤细胞株( U87，中央)、小胶质细胞株( C13，右)中发现3种组蛋白修饰的表基因组区域与BRD4结合的表基因组区域的重叠情况用本图表示。 三种组蛋白修饰( H3K27ac、H4K5acK8ac、H3K4me3)和BRD4在ChIP-seq分析中检测到的表基因组区数目分别显示在重叠位置。 近年来，关于癌症发生的机制，少数干细胞制造大量癌细胞的“癌症干细胞”的存在备受瞩目。 因此，我们的目标是找出H4K5acK8ac和H3K27ac在胶质瘤干细胞株中的作用差异。 首先，将具有这两个乙酰化修饰的表基因组区域按照H4K5acK8ac的比率由低到高的顺序分为6类，研究与在癌干细胞株中高表达的BRD4的共定位的比例是否每组发生变化，结果显示H4K5acK8ac的比例 这与试管内直接结合的分析结果一致，表明在细胞内，BRD4也与H3K27ac相比与H4K5acK8ac结合得更好。 通过阻碍BRD4和表基因组区域的结合，癌细胞的基因表达模式接近正常细胞的基因表达模式的情况已经为人所知。 因此，我们分析了添加表基因组结合的抑制剂、被期待具有抗癌剂效果的化合物JQ1[11]时胶质瘤干细胞株的表基因组。 结果表明，在与基因表达调控相关的启动子[1]和增强子中，添加JQ1使BRD4几乎完全从表基因组解离，而H4K5acK8ac极其顽强地维持在表基因组中(图3B )。 该结果与联合研究组以前在肺癌细胞株上报告的结果注1 )一致，认为H4K5acK8ac的顽强性是许多癌细胞表基因组共同存在的特征。 图3胶质瘤干细胞株中H4K5acK8ac和BRD4的共定位及结合抑制剂的影响
此外，为了验证H4K5acK8ac是否成为超级增强子的指标，我们按照H4K5acK8ac和H3K27ac数量从多到少的顺序对增强子区域进行了排序(图4 )。 这些乙酰化修饰特别多的区域被认为是明显提高基因表达的超级增强子。 以H4K5acK8ac和H3K27ac各自的数量为指标对该超级增强子进行判定，调查被判定为超级增强子的区域所控制的靶基因时(图4A、c )，约半数的超级增强子区域与控制靶基因重复，但约4成的超级增强子区域和控制靶基因仅在H4K5acK8ac或H3K27ac的某一指标中发现(图4B )。  图4通过以4 H4K5acK8ac为指标的排序重新定义超级增强子 以H4K5acK8ac(A )或H3K27ac(C )的信号为指标对胶质瘤干细胞的增强子进行了排序。 特别是信号数量多的超级增强子及其调控靶基因分别显示在图中。 横轴表示从较少的一方开始排列检测出的纵轴信号数时的顺序。 图的右侧显示了各个超级增强子控制的代表性基因。 基因右侧括号内的数字表示从纵轴信号数多的一方开始排列时的顺序。 基因的颜色为，红色为仅在H4K5acK8ac排序中发现超级增强子的控制靶基因，蓝色为仅在H3K27ac排序中发现超级增强子的控制靶基因，黑色为在两者排序中共同发现超级增强子的控制靶基因 本图( b )显示的是用H4K5acK8ac或H3K27ac判定的超级增强子(峰)的数量和调控靶基因的数量。 根据H4K5acK8ac和H3K27ac指标判断的近半数超级增强子不同，验证了仅在两者各自指标中被判断为超级增强子的区域的作用。 在由H4K5acK8ac指标判定的超增强子中，基于CRISPR/Cas9方法的基因组编辑[12]中缺失了控制癌基因( MYCN和NFIC )的、在H4K5acK8ac数量上位于前列的超级增强子，并验证了其影响。结果表明，超级增强子缺失不仅会显著减少MYCN和NFIC的表达，而且会显著降低胶质瘤干细胞的细胞增殖能力，与胶质瘤干细胞性相关的其他基因的表达也会显著减少。 此外，胶质瘤的干细胞会形成细胞粘附在一起的细胞团，但如果缺乏控制MYCN和NFIC的超级增强子，细胞团的形成能力也会明显降低(图5 )。 另一方面，对根据H3K27ac指标被特异性判定为超级增强子的多个基因组DNA区域也进行了同样的研究，但据本研究调查，没有发现与用H4K5acK8ac指标判定的超级增强子相同的倾向。  图5以5 H4K5acK8ac为指标发现的超级增强子对胶质瘤干细胞性的干预 基因组编辑缺失癌基因超级增强子的胶质瘤干细胞株的相位差图谱。 光栅尺表示50微米( m，1 m为百万分之一米)。 未进行基因组编辑的细胞株(左)形成了作为培养干细胞特征的细胞块，与此相对，如果使控制MYCN (中)和NFIC (右)的超级增强子在基因组编辑中缺失，细胞块的形成能力就会降低。 这些分析结果表明，除了以往的表基因组研究中作为超级增强子的判定标准之一的H3K27ac之外，H4K5acK8ac的检测还是精密判定超级增强子的有效方法(图6 )。  图6以组蛋白H4高乙酰化状态为指标的超级增强子的判定方法 作为活化染色质指标的H3K27ac判定的超级增强子，没有与和癌症关系密切的BRD4结合，而且即使在基因组编辑中缺失也仍然维持着癌症干细胞性。 另一方面，在H4K5acK8ac中判定的超级增强子是BRD4结合的靶，如果在基因组编辑中缺失，则会丧失癌干细胞性。
今后的期待超级增强子作为在癌细胞和炎症等疾病中失控疾病相关基因表达的一个原因，近年来备受关注。 在超级增强子的形成中，关键是许多癌细胞共同表达的BRD4等蛋白质与表基因组的乙酰化区域结合。 但是，领导细胞内表基因组研究的国际联盟注3，4 )推荐的分析组蛋白的乙酰化修饰仅限于H3K27ac和组蛋白H3的第9个蓖麻毒素残基的乙酰化( H3K9ac )。 组蛋白的乙酰化修饰除了H3K27ac和H3K9ac以外，还已知在许多组蛋白和残基中发生，特别是组蛋白H4的高乙酰化修饰被认为是在使母细胞继承表基因组信息、激活基因转录方面的重要修饰。注5 ) 本研究表明，以组蛋白H4的高乙酰化修饰H4K5acK8ac为指标的超级增强子的判定方法具有比传统的超级增强子的判定方法更好的特点。 在这次的研究中，选择了难治性疾病的一种胶质母瘤细胞作为模型系统，但是本方法无论细胞种类都可以利用。 今后，通过用这次开发的方法重新定义存在于各种疾病细胞中的超级增强子，可以期待与至今为止没有发现的疾病控制基因的发现和疾病状态的精密诊断技术的开发相联系。 补充说明
联合研究组理化研究所 生命功能科学研究中心 表观遗传学控制研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)梅原崇史 (现创药蛋白质分析基础单元高级研究员) 研究员(研究当时) Nando D. Das 技师(研究当时)渡边寿美 生命医学科学研究中心 表基因组技术研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)蓑田亚希子 (现拉德鲍多大学(荷兰)副教授) 研究员(研究当时) Jen-Chien Chang 特别研究员(研究当时) S. Tomas Kelly 基因组信息分析小组 团队领导Chung-Chau Hon 特别研究员(研究当时) Marina Lizio 基因组控制网络研究小组 研究员Bogumil Kaczkowski 生命医学科学研究中心 副中心主任古关明彦 (免疫器官形成研究小组组长) 免疫器官形成研究小组 研究员伊藤伸介 名古屋大学 研究生医学系研究科肿瘤生物学 教授近藤丰 助教(研究当时)胜岛启佑 未来社会创造机构 特任教授夏目敦至 研究支援本研究涉及日本学术振兴会( JSPS )科研经费资助事业学术变革领域( a )“从DNA物性理解的基因组学(领域代表者:西山朋子)”，同基础研究( b )“操作在癌细胞中顽强维持的超乙酰化表基因组(研究代表者:梅原崇史) 同基础研究( c )“以高乙酰化组蛋白H4为指标的活化增强子的再定义(研究代表者: NAND das )”，日本医疗研究开发机构( AMED )新一代癌症医疗创制研究事业“以与癌细胞分化控制相关的表基因组为目标的创新疗法的开发(研究代表者:近藤丰 AMED创新前沿研发支持事业( AMED-CREST )“基于表基因组研究的诊断·治疗新技术的创造(研究综述:山本雅之)”的研究课题“表观遗传增强子动态调控机制的阐明及其在细胞功能调控中的应用(研究代表者:古关明彦) 科学技术振兴机构( JST )战略性创造·研究推进事业·个人型研究( PRESTO，先驱)“细胞功能的构成性理解和控制(研究领域总结:上田泰己)”的研究课题“'表核苷酸体’的精密重构引起的基因表达·控制分析(研究者:梅原崇史)”等的资助下进行。 原论文信息
主讲人 理化研究所 生命功能科学研究中心 表观遗传学控制研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)梅原崇史 (现创药蛋白质分析基础单元高级研究员) 研究员(研究当时) Nando D. Das 生命医学科学研究中心 表基因组技术研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)蓑田亚希子 (现拉德鲍多大学(荷兰)副教授) 生命医学科学研究中心 副中心主任古关明彦 (免疫器官形成研究小组组长) 名古屋大学 研究生医学系研究科肿瘤生物学 教授近藤丰 |
|
|
