血涂片制备及染色注意事项...

来源：UJS医学检验毕业生、检验星空

编辑：小带

血涂片看似很基本，却是技术活。做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。没有制备/染色良好的血涂片，想正确识别血细胞无异于天方夜谭。

参考人民卫生出版社《临床检验基础》、《临床基础检验学技术》教材、中华人民共和国卫生行业标准(白细胞分类计数参考方法)（WS/T 246-2005），整理血涂片的制备/染色/观察方法，仅供战友学习参考。

一、载玻片的要求

载玻片是用显微镜观察东西时用来放东西的玻璃片或石英片，呈长方形，大小为76*26 mm，较厚，透光性较好。使用时可将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟，再用自来水洗去肥皂和血膜等污物，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用，彻底清洗游离碱质。

二、血涂片制备方法

血涂片是血液细胞学检查的基本方法，应用极广。特别是对各种血液病的诊断有很大价值。但血片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。

常规使用薄血膜退片法，可分为采血、制备血涂片、干燥三个步骤，如下所示：

涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片间夹角、推片速度、血细胞比容有关。

值得一提的是取血量：

左侧小血滴是5ul的，右侧大血滴是50ul的。

不少资料都在这里犯了错误，比如全国临床检验操作规程第3版/第4版都说取0.05ml血（50ul），从上图不难看出，这么多血是不可能制备出良好血涂片的；推荐取5ul左右，最好是不抗凝的静脉血或者手指血；EDTA抗凝血也可用，但并不是最好的选择。

三、良好血涂片的标准

由厚到薄均匀过渡，厚薄适宜，头/体/尾分明，分布均匀，边缘整齐，两侧留有空隙，末端呈方形或羽毛状，无粒状/划线或裂隙（会使白细胞分布不均匀，集中在这些区域内）。

血涂片外观应头、体、尾分明，分布均匀，边缘整齐，两侧留有空隙。

四、血涂片的染色

（一）染料

1、瑞氏染色法：

①瑞氏染料由酸性染料伊红（E－）和碱性染料亚甲蓝（M＋）组成。

②染色原理：

既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，可根据染色来判断细胞。

2、吉姆萨染色法：

染色原理与瑞氏染色法大致相同。吉姆萨染料由天青和伊红组成。本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更为清晰，但细胞质和颗粒着色较差。

3、瑞氏-吉姆萨复合染色法：

兼顾两者之长，将瑞士染粉和吉氏染粉混合，用甲醇溶解即瑞-吉液，用瑞-吉液进行染色，使血细胞的颗粒及细胞核均能获得满意的染色效果。

（二）染色方法

瑞氏/瑞吉染色方法：待血涂片干透后，用蜡笔在其两端划线，以防染色时染液外溢。具体如下所示：

五、血涂片染色良好的特征

染色良好的血膜片，外观呈浅红色，红细胞呈粉红色，白细胞核呈暗紫红色， 染色质结构能辨，粒细胞的颗粒呈固有种异颜色。

染色时间应视具体情况而定，特别是更换新染料时必须经试染，摸索最佳染色条件。

六、血涂片检查步骤

1、首先在低倍镜下（10倍～40倍）进行浏览，观察有无异常细胞和细胞分布情况。然后，在100倍油镜下，观察细胞浆内的颗粒和核分叶情况。 

2、检查从约50％的红细胞互相重叠区域开始，向红细胞完全散开的区域推移。血涂片较薄的区域，呈羽毛状，为“血片边缘”。 

3、中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞分布均匀的区域为血涂片分类“可接受”区域。当白细胞总数正常时，在血涂片尾部和边缘，每油镜视野所见的白细胞数量不超过血涂片体部的2～3倍。 

4、除某些病理情况（如慢性淋巴细胞白血病）外，破碎细胞或不能识别细胞的数量不超过白细胞总数的2%。若破碎细胞仍能明确鉴别（如破碎的嗜酸性粒细胞）应包括在分类计数中。在结果报告中，应设其他栏，以备填写破碎细胞或不能识别细胞，并作适当描述。 

5、计数方法

（1）采用“城垛式”方法检查血涂片（图1）。每个明确识别的细胞必须归入下列分类中：中性分叶核粒细胞；中性杆状核粒细胞；淋巴细胞；异型淋巴细胞；单核细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；其他有核细胞（除有核红细胞外）。能明确识别的破碎细胞，应恰当分类。

【笔者注】实际工作中，有些同行习惯这样检查血涂片：

这也是可以的。

（2）每张血涂片应计数200个白细胞，若样本中白细胞数量减少，应增加检查血涂片的数量。

【笔者注】不过，一般的教科书的要求如下：

所以，并不是一定要计数200个白细胞

（3）白细胞分类结果以百分率和绝对值表示。 

（4）计数所有的有核红细胞，结果以每100个白细胞计数中见到几个表示。

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