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目前，真核生物合成生物学的进展仍主要集中在酿酒酵母上，从酿酒酵母到哺乳动物是从低配真核生物到高配真核生物的等级跨越，工程化的难度自然要高出许多。如果能够实现对哺乳动物细胞中的遗传和细胞活动的精确、可扩展和可持续的控制，将更利于开发精准治疗和智能生物制造。 谈到基因表达的调控，首先想到的就是在启动子上面“下功夫”。使用这种方法有诸多注意事项。 在基因表达平台中使用强组成型启动子会增加靶基因的表达，从而导致不需要的、剂量依赖性的副作用，从而引发安全问题。又或者，启动子替换是一种简单且常用的改变基因表达的策略。但优化细胞类型特异性或基因特异性天然启动子需要大量努力，在实现所需的生物学表型或治疗结果方面的成功有限。 卢冠达实验室的研究人员选择通过设计转录因子 (TFs) 和转录激活域 (TADs) 来控制转录活动。 2013 年，合成生物学大牛卢冠达（Timothy K. Lu）实验室的研究人员开发了一种基于 CRISPR 的转录因子，实现了更轻松地控制哺乳动物和酵母细胞中天然存在的基因的转录。如今，在这项工作的基础上，研究人员又创建了一个合成生物部件库，从而能够传递转基因——一种细胞通常不表达的基因——并精确控制其表达。 该技术可微调有用蛋白质的产生，例如用于治疗癌症和其他疾病的单克隆抗体，或细胞行为的其他方面。该系统在多种哺乳动物细胞类型中始终如一地发挥作用，因此具有足够的通用性，可用于生物医学和生物制造的各种细胞模型。相关文章以题“A synthetic transcription platform for programmable gene expression in mammalian cells”发表于 Nature Communications 。 南达科他大学（the University of South Dakota）生物医学科学助理教授 William CW Chen，以及麻省理工学院研究科学家 Leonid Gaidukov 和博士后 Yong Lai，三位研究人员为本文共同第一作者。William CW Chen 与卢冠达（Timothy K. Lu）为本文共同通讯作者。 研究人员设计的 crisprTF 启动子系统包括几个组件。其一，要转录的基因；其二，“操作者”序列，它由一系列人工转录因子结合位点组成；其三，向导 RNA，它与那些“操作者”序列结合；其四，与失活的 Cas9 蛋白相连的转录激活结构域。
▲图丨一个基于 crisprTF 的转录系统的可编程和模块化设计的示意图（来源：Nature Communications） 当这种失活的 Cas9 蛋白在合成启动子位点与向导 RNA 结合时，基于 CRISPR 的转录因子可以开启基因表达。 值得一提的是，为了不让该系统影响到细胞自身基因组中的基因，研究人员设计该合成系统的启动子位点与天然存在的启动子位点不同。 每个“操作者”序列都包含 2~16 个向导 RNA 结合位点的拷贝。研究人员发现，这一系统能够以与结合点数量线性对应的速率启动基因转录，从而使他们能够精确控制所产生的蛋白质数量。 “这是一个高度可预测的系统，我们可以在计算机上预先设计，并得到预期的结果，”文章的第一作者之一 William CW Chen 说。 更重要的是，文章指出这个系统适用于不同细胞类型的许多不同生物医学应用。该结论已经得到验证。 研究人员在几种类型的哺乳动物细胞中测试了这一系统，包括中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、小鼠和大鼠成肌细胞（肌肉细胞的前体）、人类胚胎肾细胞和人类诱导的多能干细胞。其中，中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞通常用于在工业生物反应器中生产治疗性蛋白质。 测试发现，在 CHO 细胞和其他细胞中呈现了非常相似的结果。也就是说，该系统在不同的细胞类型和不同的目标基因上具有非常高的一致性。且在多种细胞类型中，其活性比 EF1α 启动子高出 25 倍。 对此，William CW Chen 表示，“这是思考通过高度可调、可预测的人工系统调节基因表达和细胞行为的一个很好的起点。” 为了在更大范围内扩展可调性，研究人员在基于 crisprTF 的系统中加入了额外的遗传控制元件以增强基因表达，并且通过基因组整合精确控制基因表达。 在首先证明可以使用新系统诱导细胞产生预期数量的荧光蛋白之后，研究人员表明还可以用它来编程生产一种被称为 JUG444 的单克隆抗体的两个主要部分。研究人员还对 CHO 细胞进行编程，使其产生不同数量的称为抗 hPD1 的人类抗体。
▲图丨人单克隆抗体 (mAb) 生产的精确控制（来源：Nature Communications） 可以说，通过这一系统，研究人员能够高产所需抗体。但是，想要将这一系统纳入工业流程，还需要进一步的工作。 与工业生物反应器中使用的细胞不同，该系统使用的细胞是生长在一个平面上的，而不是在液体悬浮液中。因此，想要将该系统发展为工业应用系统，首先要让该系统能够适用于悬浮细胞。 这也是该研究的下一步工作，就是测试使用不同的“悬浮细胞”与“平面上的细胞”时，它们是否以同样的方式制造蛋白质。 这项研究得到了辉瑞-麻省理工学院 RCA 合成生物学项目、国家科学基金会、国家卫生研究院、南达科他大学桑福德医学院、美国国立卫生研究院 Ruth L. Kirschstein NRSA 博士后奖学金和美国国防部的资助。 |
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