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2001 年，合成生物学家 James Collins 与 Michael B. Elowitz 和 Stanislas Leibler 的两篇开山之作——“拨动开关”（两个相互抑制的转录因子）和“振荡器”（三重负反馈环构成），奠定了合成生物学中基因线路这一重要分支。 “基因线路”的概念来源于电子计算机。电子计算机的核心是各种逻辑之间的电路运算；而自然生物利用各种 RNA、蛋白质和修饰的 DNA 调节器来控制基因的表达，这些相互作用的调节器便形成类似于计算机运作的基因线路。 在利用基因线路对微生物这座“工厂”进行调控的合成生物学实践中，微观世界中纷繁复杂的作用机制正待人们探索，以更经济而绿色地生产人类所需的物质。近日，生辉 SynBio 对山东大学国家糖工程技术研究中心王倩教授进行了专访。从合成生物学之代谢工程的方法论到最新研究进展，王倩介绍了团队近期所取得的突破。 王倩博士毕业于山东大学，师从代谢工程与合成生物学知名学者祁庆生教授；毕业留校后，加入祁庆生领衔的微生物代谢合成与代谢调控（MBMR）团队，至今一直从事科学研究和教学工作。其主要研究方向有合成生物学、代谢工程和发酵工程。相关研究成果以第一作者或共同通讯作者发表于 Biotechnology Advances， Metabolic engineering， iScience 等期刊。 “如果说传统生物学与代谢工程是一段质朴的民谣，合成生物学则是一首激荡的狂想曲——它把生物学的基本音节全部拆解，以全新的曲风重构，通过大型的管弦乐队演绎。其构思之广阔，思想之深刻，形象之丰富，让人们对生命的认知更加透彻，也将彻底变革我们的未来生活。”王倩如此描述合成生物学的风采。
（来源：受访者提供） 细胞生物传感器，刻画基因线路的工具合成生物学旨在创造新的生物部件、设备和系统，或重新设计自然界中已经发现的系统，是一个融合多学科的研究领域。 “合成生物学需要利用已有的生物学知识探究尚不存在的客观实体；因此，不能单纯利用还原论的方法。它既要结合传统生物学观察分析方法，又要结合工程学的理念与设计思维。”王倩解释道，“在这里，工程学理念借鉴了机械工程和电子工程的设计方法，是一种针对遗传系统的工程化设计方法，具体可概括为：设计对象的抽象化处理、标准化以及分层设计。” 合成生物学中的基因线路，是由各种调控元件和被调控的基因组合而成的遗传装置。在给定的条件下，可调节并可定时定量地表达基因产物。人们利用基本的生物元件，设计和构建了基因开关、振荡器、放大器、逻辑门、计算器等合成器件，实现了对生命系统的重新编程、为其赋予了特殊功能。 通过基因线路，让细胞更多地生产人们所需的某种物质，称为代谢工程。 代谢工程的首要目标是设计反应途径。“需要哪些酶、需要多少量、在什么样的环境下反应......对这些生物元件的'标准化’刻画，远比遗传线路中的元件要清晰、精细得多，各项性能也更具标准。”然而，基因线路中的传感与调控元件的抽象化描述和标准化表征目前仍在不清晰、不充分的阶段。“遗传编码的细胞生物传感器，为表征天然和人工调控元件打开了一扇门。”这也是王倩团队所聚焦的研究方向。 细胞生物传感器通过设计好的基因回路，控制目的基因的表达，从而识别并响应特定的输入信号（细胞刺激），如温度、pH、代谢物的变化等，并将其转化为输出信号，如荧光、细胞的存活、特定代谢通路的开闭。 为了实现对代谢途径精确的动态调节和高通量筛选，细胞生物传感器还须以适当的灵敏度对输入信号做出响应。以细胞生物传感器响应代谢物浓度为例，首先，代谢物浓度必须在检测范围内；另外，在正确的代谢物浓度阈值下，根据生长条件，细胞生物传感器可以做出不同强度的响应。 据此，可形成“剂量—响应”曲线，这便是细胞生物传感器的意义：将调控元件（主要为启动子）的功能抽象化为性能参数，以此进行标准化、工程化调试。 精确量化传感器，实现重要生物分子的高通量筛选今年 1 月，王倩在 Critical reviews in Biotechnology 发表了一篇综述，题为 “Modular tuning engineering and versatile applications of genetically encoded biosensors”，对基因编码的全细胞生物传感器的模块化工程设计、构建策略、在合成生物学中的应用的最新进展进行了介绍。 该文解析了基因编码生物传感器的剂量——响应曲线中四个参数的生物学意义，包括本底泄露（basal leakage）、动态检测范围（dynamic range）、响应阈值（Response threshold）和响应灵敏度（Response sensitivity）。通过归纳多种策略，该文详细分析了如何调节和精确校准剂量——响应曲线，并总结了如何扩展输入信号以增加可检测化合物数量的策略。 本底泄露：它代表了在基因上调情况下始终激活的部分，以及在下调情况下无法完全抑制的部分。理想情况下其泄露值应该趋近于 0。 动态检测范围：一般指剂量——响应曲线垂直变化的参数，也有研究中报告曲线两端的值为动力学范围，有的研究中以曲线两端的值的倍数变化的方式来代表动力学范围（在本论文的研究中用曲线两端的值的倍数变化的方式来代表动力学范围，但在本文对生物传感器的改造过程中我们也会关注生物传感器的最大输出值）。 响应阈值：指当输出信号值达到最大响应值一半时候的代谢物浓度，也称为 EC（50）值。 响应灵敏度：是指曲线的陡度，具有陡峭或类似开关的稳态响应曲线通常被认为具有超敏性。
▲图 | 针对基因编码生物传感器的性能参数的功能调整策略（来源：受访者提供） “生物传感器剂量反应曲线的多个参数的计量，是细胞生物传感器走向精确和量化的开始。”王倩解释。 基于以上所归纳的机理，王倩团队改造了血红素生物传感器 HrtR，用于 5-氨基乙酰丙酸（ALA）生产菌株的代谢调控。ALA 作为一种环境相容性及选择性很高的新型光动力学药物和植物生长促进剂/除草剂，在医药和农业等领域应用非常广泛，前景广阔。血红素是 ALA 在内的多种高价值化学品生物合成途径的终产物。它的过量积累对细胞有害。因此，利用精细调节的生物传感器和合适的遗传控制器动态调控血红素相关途径，维持胞内游离血红素稳定，对于实现产品高效积累至关重要。 通过分子动力学模拟，该团队分析关键氨基酸突变对于 HrtR 血红素配体亲和力的影响， HrtR 突变的生物传感器的响应阈值增加了 8 倍，经改造的血红素生物传感器 HrtR 结合 CRISPRi 动态抑制关键酶基因 hemB，可将胞内血红素浓度控制在一个合理水平（0.8uM 以内）。血红素毒性降低的同时，ALA 的产量提高至 5.35g/L。 另一项突破是 N-乙酰神经氨酸（NeuAc）的生产。NeuAc 是一种羧基化的九碳单糖，是自然界中分布最广的一种唾液酸，参与诸多重要生理功能。NeuAc 是重要的药物前体，用于制造扎那米韦等抗流感病毒药物。另外，它作为燕窝的主要活性成分，被称为“燕窝酸”，可以促进婴儿大脑发育、预防老年痴呆，是应用前景广阔的营养补品及保健品。 为提高 NeuAc 的产量，“我们还筛选获得了一种高阈值和动态范围的 RNA 生物传感器—— NeuAc 的核糖开关。先前开发的核糖开关只能响应低剂量水平的 NeuAc；我们建立了一种生长偶联结合正负筛选的方法，利用该进化的核糖开关进行 NeuAc 的高通量筛选，达到了 14.32g/L 的较高产量，是之前报道产量的 2 倍。”王倩介绍道。 目前王倩还在开发基于双组分/三组分系统的生物传感器，这类传感器的响应信号更加多样，包括光、温度、pH、金属、渗透压、氧化剂、小分子代谢物、抗生素、抗菌肽、低聚糖、蛋白质、激素和细菌间通信信号等等。虽然这类传感器目前开发的较少，但具有独特优势：不仅可以感知细胞膜内的输入，还可以感知细胞外的输入。“希望我们的设计可以早日与大家见面。”王倩说。 构建双功能糖酵解通量生物传感器，促进高效人工节碳途径的底盘适配糖酵解是细胞代谢的基本途径。维持糖酵解通量和产物合成途径的平衡，是细胞工厂关注的主要问题之一。高通量导致过度代谢和细胞过度生长，而低速率则导致细胞生长缓慢和产物滴度降低。因此，使用适时的自主糖酵解通量调节方法控制代谢流，对于优化细胞工厂和维持细胞稳态极为重要。 近日，王倩在 Metabolic Engineering 和 Microbial Biotechnology 连续发表了新研究“Development of bifunctional biosensors for sensing and dynamic control of glycolysis flux in metabolic engineering”及“De novo design of the global transcriptional factor Cra-regulated promoters enables highly sensitive glycolysis flux biosensor for dynamic metabolic control”。其团队设计、构建和表征了一种双功能糖酵解通量生物传感器，有助于精确调控大肠杆菌代谢通量。 该通量传感器的设计基于大肠杆菌的中枢代谢的调节模型。糖酵解关键中间体果糖-1，6-二磷酸（FBP）能够协同糖酵解上游与下游的通量，其浓度会影响转录因子的活性，从而以通量依赖的方式进行胞内转录调控。基于全局转录因子 Cra 响应 FBP 变构调控（包括上调和下调）相应启动子，该团队同时构建了激活型和抑制型的糖酵解生物传感器。 接着，该团队筛选结合能力强的转录因子结合位点（TFBS），控制 Cra 表达强度，改进 Cra 与配体的亲和力，使生物传感器的动力学范围增大至 5000 倍，阈值调整至胞内 FBP 的浓度范围（16.5-85mM）。双功能糖酵解通量生物传感器能够表征不同基因缺失菌株胞内 FBP 的浓度，可用于动态调节胞内糖酵解通量。 值得注意的是，为了减少全局转录因子的过表达和结构改变对宿主全局代谢产生的影响负担，王倩团队着眼于从头设计响应启动子，采用系列人工启动子以及 T4 噬菌体来源的严谨型启动子，对核心启动子的强度梯度、TFBS 个数的串联、TFBS 与启动子间距进行设计，获得了动力学范围达到 9000 倍以上、灵敏度高的通量生物传感器。 “将该传感器应用于大肠杆菌丙酮酸生产过程的 ATP 能量水平调控，动态抑制 atp 基因簇，得到了产量较高（9.66g/L）的丙酮酸；同时，还实现了动态调控大肠杆菌生物质膜合成相关基因 plsC，番茄红素的产量与对照菌株相比提高了 50 倍。”王倩介绍道。丙酮酸是一种基本化工原料，广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域。番茄红素则具有很强的抗氧化功能，是食品、保健品的重要原料。
▲图 | 基于 Cra 的糖酵解通量生物传感器的启动子从头设计（来源：受访者提供） 诚然，利用微生物以合成生物学方法的生产过程，与传统工业相比降低了能耗、物耗，减少了废物排放与空气、水及土壤污染，大幅度降低了生产成本。不过，由于微生物这所工厂所利用的能源是碳源，追求更加低碳的生物制造对于绿色经济亦有十分重要的贡献。 “微生物菌种是绿色低碳生物制造的核心。对微生物天然碳代谢途径进行改造，以实现更大程度的碳保留，提高生物制造菌种的碳原子经济性，与开发人工固碳途径一样，也是减少碳排放、实现高效生物制造的有效途径之一。” 目前，对于以淀粉葡萄糖作为底物的转化，由于天然糖酵解途径（EMP）导致 1/3 的碳以二氧化碳形式损失，糖的转化效率仍然比较低。王倩聚焦这一问题，在大肠杆菌中构建了一条人工节碳糖酵解途径 EP-bifido，首次将 EMP 途径、磷酸戊糖途径和双歧途径“bifid shunt”相结合，将 1 分子的 6-磷酸葡萄糖（EMP 途径中的一种重要中间产物）转化为 2.5~3 分子的乙酰辅酶 A，同时产生 NADPH。“甲羟戊酸生产的碳转化率达 64.3mol%，是目前已报道的最高水平。”
▲图 | 人工糖酵解途径 EP-bifido 的设计（来源：受访者提供） 王倩表示，虽然人工途径在天然底盘中显示了非常明显的效果，但是由于其与底盘细胞整体代谢网络之间存在竞争及适配性不足，接下来，我们将开发的糖酵解通量生物传感器用于人工糖酵解途径中 EMP 的下调，可以有效平衡 EP-bifido 和天然糖代谢，增强了甲羟戊酸和 N-乙酰葡萄糖胺（具有促进关节软骨再生、减缓关节疼痛、改善糖尿病与肝炎症状以及增进免疫能力的功效）两种化学物质的生物合成。在传感器的控制下，大肠杆菌菌株在 1L 发酵罐中的甲羟戊酸产量达到了 111.3g/L，是目前报道的最高水平，已经具有工业转化潜力。 另外，王倩表示，人工代谢与底盘细胞代谢之间潜在的代谢扰动及调控问题仍然存在，“未来将着力解决这一问题，并期待 1-2 年内开发出一个高效碳保留的工程菌株，以满足工业化和商业化要求。” 王倩所在的 MBMR 团队正在与相关企业合作，实现了有机酸、氨基酸类产品的产业转化。其“利用多层精细表达调控技术、生物传感偶联的高通量筛选技术开发的菌种，在未来的应用更加值得期待。” |
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