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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 导读
苗酸汤（MSS）是贵州黔东南地区的一种发酵产品，富含多种有益成分，在全中国广泛食用。发酵食品有益于身体健康，对单纯性肥胖有潜在的积极调节作用。在本研究中，我们通过蛋白质组学和代谢组学分析了MSS预防高脂饮食（HFD）诱导的单纯性肥胖的作用机制。我们采用串联质谱标记的定量蛋白质组学和液相色谱-质谱分析MSS干预后肝脏蛋白质和代谢产物的变化。MSS干预上调了33种蛋白质和9种代谢产物，下调了19种蛋白质和10种代谢产物。生物信息学分析表明，MSS可以通过作用于PPAR信号通路、视黄醇代谢、脂肪酸b氧化、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙酮酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）和其他信号通路来预防单纯性肥胖。这项研究为使用MSS预防由高脂肪饮食引起的单纯性肥胖以及使用MSS寻找健康饮食模式提供了新的见解。 原名：Integrative proteomics and metabolomics of Guizhou Miao Sour Soup affecting simple obese rats译名：贵州苗酸汤对单纯性肥胖大鼠的综合蛋白质组学和代谢组学研究
期刊：Frontiers in
Nutrition通讯作者单位：贵州医科大学公共卫生与健康学院和贵州省食品营养与健康工程研究中心
我们评估了MSS对喂养高脂饮食的大鼠体重和体脂肪沉积的影响，如图1A–D所示。在实验开始前，50只大鼠被分为5组，分别为正常饮食（ND）组，正常饮食加MSS处理12周（NDS）组，高脂饮食组（HFD）组，高脂饮食加MSS处理12周（HFDS）组，以及高脂饮食加6周MSS处理后再用去离子水处理6周（HFDIS）组，在第12周结束时，五组之间的体重没有差异（P>0.05）。HFD组的体重高于ND组（P<0.05），HFDS组的体重低于HFD组和HFDIS组（P<0.05），HFDIS组与HFD组的体重差异无统计学意义（P>0.05）。此外，HFD组的肥胖指数、Lee’s指数和肝脏指数高于ND组和HFDS组（P<0.05），与HFDIS组无差异（P>0.05），HFDS组低于HFDIS（P<0.05）。ND组与NDS组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明，MSS的干预降低了高脂饮食喂养大鼠的体重增加和体脂肪沉积。
图1 苗酸汤对高脂饮食喂养大鼠体重和脂肪沉积的影响（A）12周内大鼠的体重。（B）大鼠脂肪指数。（C）老鼠Lee’s指数。（D）大鼠肝脏指数。ND：正常饮食+蒸馏水（12周）；NDS：正常饮食+MSS（12周）；HFD：高脂饮食+蒸馏水（12周）；HFDS：高脂饮食+MSS（12周）；HFDIS：高脂饮食+MSS（前6周），然后蒸馏水（后6周）。*p<0.05表示有显著差异，ns表示无显著差异（ND vs. NDS，HFD；HFD vs. HFDS，HFDIS；HFDS vs. HFDIS）。我们检测了肥胖大鼠血脂水平和FBG的变化，以评估MSS对糖脂代谢的影响。图2A–E显示了各组中TG、TC、LDL-C、HDLC和空腹血糖（FBG）的结果，如图所示，HFD组的血清TG、TB、LDL-C和FBG高于ND组（P<0.05），HDL-C浓度降低（P<0.05）。HFDS组的血清TG、TC、LDL-C和FBG低于HFD组（P<0.05），但HDL-C升高（P<0.05）。ND组和NDS组之间以及HFDIS组和HFD组之间的TG、TC、LDL-C、HDL-C和FBG结果无差异（P>0.05）。肝脏H&E（图2F）和油红O（图2G）染色结果显示，ND和NDS组的肝细胞形状正常，排列整齐，未观察到明显异常。HFDIS组在MSS灌胃干预6周后改为蒸馏水，HFDS组完成为期12周的干预。HFDIS组与HFD组相似，细胞脂肪变性明显，细胞质内有大小不等的圆形空泡，表明MSS的整体干预可以有效改善肝脏脂肪沉积。
图2 MSS对HFD喂养大鼠血脂水平、空腹血糖（FBG）和肝脏脂肪形成的影响（A）甘油三酯（TG）。（B）总胆固醇（TC）。（C）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。（D）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。（E）空腹血糖。（F）大鼠肝脏HE染色的代表性图像，红色箭头指向脂肪泡。（G）大鼠肝脏油红O染色的代表性图像，绿色箭头指向脂肪沉积。p<0.05表示有显著性差异，ns表示无显著性差异。为了揭示MSS对高脂饮食引起的单纯性肥胖大鼠的具体作用机制，我们对五组大鼠的肝脏进行了TMT定量蛋白质组分析。主成分分析（PCA）显示了组间和组内的差异（图3A）。该结果中共鉴定出7218个蛋白质。聚类热图的结果显示各组之间不同蛋白质表达的差异（图3B），红色表示上调，绿色表示下调。其中，与HFD组相比，HFDS组中有76个蛋白上调，50个蛋白下调（图3C）。KEGG途径分析表明，这些差异蛋白主要参与生物过程，如脂质代谢和氨基酸代谢反应（图3D）。HFDS组较HFD组上调33个蛋白表达，而HFD组较ND组下调33个蛋白表达。HFDS组较HFD组有19个蛋白表达下调，而HFD组较ND组有19个蛋白表达上调(表1)。
图3 使用蛋白质组学鉴定和分析HFD喂养大鼠肝脏中的差异表达蛋（DEPs）（A）所有肝脏样品的定量蛋白质主成分分析（PCA）结果。（B）DEPs的聚类图。红色和绿色分别代表显著的向上和向下调。（C）HFDS与HFD组的火山图。红点和绿点分别代表显著上调和下调的差异蛋白。黑点表示没有差异的蛋白质。（D）DEPs前20个KEGG富集途径的气泡图。倍数富集是该功能类型中差异表达蛋白的比例与鉴定蛋白的比例相比的折叠变化的Log2转化值。表1 52个差异表达蛋白(DEPs)是三个组(ND, HFD, HFDS)共有的
为了揭示MSS对由高脂饮食喂养引起的单纯性肥胖大鼠的具体作用机制，我们进一步对五组大鼠的肝脏进行了代谢组学分析。PCA显示了组间和组内的差异（图4A）。我们在本次实验中共鉴定出4961个代谢物，其中正离子(POS) 2369个，负离子(NEG) 2592个，并且聚类热图的结果显示各组之间不同代谢物的差异（图4B），红色表示上调，绿色表示下调。与HFD组相比，HFDS组有47种代谢物上调，71种代谢产物下调（图4C）。这些差异代谢物的KEGG途径分析主要涉及生物过程，如脂肪酸代谢和氨基酸代谢反应（图4D）。HFDS组与HFD组相比，共有9种代谢产物含量上调，HFD组与ND组相比，这些代谢产物含量下调；HFDS组与HFD组相比，共有10种代谢产物含量下调，HFD组与ND组相比，这些代谢产物含量上调(表2)。表2 三个组(ND, HFD, HFDS)共有的19个差异代谢物
图4 使用代谢组学鉴定和分析HFD喂养大鼠肝脏中的差异代谢物POS表示质谱中带有正离子的代谢物，NEG表示质谱中带负离子的代谢物。（A）所有肝脏样品的代谢物主成分分析（PCA）结果。（B）不同代谢物的聚类图。红色和绿色分别代表显著的向上和向下调。（C）HFDS与HFD组的火山图。红点和绿点分别代表显著上调和下调的差异代谢物。（D）不同代谢物的前20个KEGG富集途径的气泡图。富因子定义为注释到通路的差异代谢物数量除以注释到通路中的所有已识别代谢物。52种不同蛋白质和19种不同代谢物的数据上传至metaboanalyst 5.0，以分析MSS对高脂饮食喂养大鼠肝脏的整体干预效果及其机制（图5A、B）。我们使用Cytoscape绘制蛋白质-代谢物相互作用网络（图5C），结果表明，蛋白质和下游代谢产物主要富集于PPAR信号通路、视黄醇代谢、脂肪酸b氧化、脂肪酸降解和脂肪酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙酮酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）等途径。
（A）KEGG途径及其影响和意义。通路影响是中心性和通路富集结果的组合，它是以客观方式衡量中心性或“hubness”的工具。(B)差异显著的KEGG富集途径及其命中数。（C）差异蛋白质和差异代谢物的蛋白质-代谢物相互作用网络，红色表示MSS干预后上调，绿色表示下调。椭圆表示蛋白质，矩形表示代谢物，红色表示MSS干预后上调，绿色表示MSS干预后下调。在上述途径中上调的蛋白质如下：视网膜脱氢酶（ALDH1A）、脂肪酸结合蛋白5（FABP5）、乙酰辅酶A酰基转移酶1（ACAA1）、2，4-二烯基-CoA还原酶（DECR2）、3，5-十四二烯基辅酶A异构酶（ECH1）和peroxin-11A（PEX11A）、乙酰辅酶A酰基转移酶2（ACAA2）、烯酰辅酶A水合酶（HADHA）、烯酰辅酶A氢化酶（ECHS1）。在上述途径中被下调的蛋白质如下：乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）、脂肪酸合成酶（FASN）、甜菜碱同型半胱氨酸S-甲基转移酶（BHMT）、甘氨酸N-甲基转移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK1）、ATP柠檬酸盐（pro-S）裂解酶（ACLY）。在上述途径中上调的代谢物如下：还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、甜菜碱和丙酮酸。在上述途径中被下调的代谢产物如下：脂肪酸（亚油酸、花生四烯酸、g-亚麻酸、a-亚麻酸和十八酸）。结果提示MSS的干预可能通过上述生物反应促进代谢，从而改善代谢紊乱，预防高脂饮食大鼠单纯性肥胖的发展。
图6 苗酸汤改善HFD喂养大鼠肝脏能量代谢的示意图椭圆表示蛋白质，矩形表示代谢物，红色表示MSS干预后上调，绿色表示MSS干预后下调。图6是本研究结果的概况图，与同时喂食MSS和高脂饲料12周的大鼠相比，喂食高脂饲料诱导的单纯性肥胖大鼠在MSS干预后体重、空腹血糖、血脂和体脂沉积水平显著降低，肝脏脂肪变性和脂质沉积明显改善(图1,2)。我们还建立了一个NDS组，以证明MSS对正常饮食的大鼠（ND组）没有不良健康影响。有趣的是，我们发现，在MSS半程干预后停止干预的大鼠（HFDIS组）在各项指标上与HFD组的结果相似。提示MSS的持续干预显著改善了高脂饮食引起的机体脂质代谢紊乱，但可能需要继续进行饮食干预。蛋白质组学和代谢组学的结果表明，MSS干预促进了肝脏中的脂质氧化，减少了脂质合成，并导致肝脏中脂肪酸代谢消耗大量能量，从而恢复肝脏中因高脂饮食过度积累而产生的脂肪酸含量正常水平。同时，MSS的干预还调节了高脂饮食喂养大鼠的丙酮酸代谢过程和其他生物过程，进一步改善了高脂膳食大鼠的代谢紊乱过程。脂质在身体的生命活动中起着重要作用，直接参与细胞信号通路和基因转录的调节，也是身体中重要的能量底物。膳食脂肪酸在肠内被胆汁酸乳化成细小的微聚集体，被肠粘膜细胞吸收，包装成腹腔颗粒，运输到肝脏。在肝细胞中，脂肪酸主要被运输到线粒体进行b氧化以产生乙酰辅酶A，它进入柠檬酸循环，然后被完全氧化，为身体释放大量能量。多余的脂肪酸被加工成甘油三酯或胆固醇酯，储存在脂滴（LD）中，或形成极低密度脂蛋白（VLDL），分泌到血液中，并输送到肝外组织中起作用。PPAR信号通路在脂质代谢中起关键作用，调节参与脂质氧化和代谢的下游基因，而视黄醇代谢过程与甾醇和甘油三酯代谢有关。PPAR信号通路中的FABP5是一种细胞内脂质伴侣小分子，它与疏水配体(如长链脂肪酸)结合，并将其运输到细胞器(如线粒体)进行进一步代谢，线粒体是能量代谢的关键细胞器，ALDH1A1负责视黄醇代谢过程中视黄醛氧化为视黄酸，研究表明视黄酸在线粒体b氧化中起关键作用，其上调促进脂质代谢过程。脂肪酸b氧化的关键蛋白ACAA1、PDCR2、ECH1、Pex11a、ACAA2、HADHA和ECHS1被上调。ACAA1、PDCR2、ECH1和PEX11A是过氧化物酶体途径中的重要蛋白质，在脂质代谢中起核心作用，PEX11A为过氧化物酶中的关键酶，其缺乏会损害过氧化物体的丰度和脂肪酸b氧化，并导致肝脏甘油三酯的积累。ACAA1广泛存在于人类和动物中，并催化从游离胆固醇和长链脂肪酸合成酯化胆固醇。PDCR2是多不饱和脂肪酸（PUFAs）b氧化的关键酶，研究表明，PDCR2的敲低导致不饱和脂肪酸的氧化减少，从而允许脂质积累。Ech1还参与线粒体中的脂肪酸b氧化。ECHS1、HADHA和ACAA2是脂肪酸羰基化的关键酶，催化十六烷基辅酶A最终转化为乙酰辅酶A，并且研究表明，ECHS1酶缺乏导致ATP产生受损以及脂肪酸积累，HADHA过表达减少胞质LD形成，而ACAA2通过催化相应b氧化途径的最后一步参与线粒体脂肪酸的延长和降解，其过表达抑制甘油三酯的产生。另一方面，MSS干预降低了单纯性肥胖大鼠肝脏中参与脂肪酸合成的FASN、ACACA和参与三羧酸循环的ACLY的表达。FASN是脂肪酸从头合成的关键酶，并使用乙酰辅酶a作为引物，丙二酰辅酶A作为双碳供体，NADPH作为还原等价物，用于合成长链脂肪酸。ACACA可以催化乙酰辅酶A的羧化形成丙二酰辅酶A，是脂肪酸从头合成的限速和关键调控步骤。目前认为，抑制乙酰辅酶A羧化酶作为一种药物开发手段可能对非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者的治疗有用。相反，三羧酸循环中的ACLY催化柠檬酸转化为草酰乙酸和乙酰辅酶A，然后促进脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱的合成，当新陈代谢受到干扰时，它会异常表达。代谢组学的进一步结果表明，肝脏中NADH的含量增加，NADH是一种关键的能量转移中间体，在能量底物氧化过程中由NAD+产生。同时，脂肪酸含量降低，主要是亚油酸、花生四烯酸、g-亚麻酸、a-亚麻酸和硬脂酸。亚油酸是花生四烯酸的前体，可产生促炎二十烷酸和内源性大麻素。g-亚麻酸可能在治疗各种慢性疾病状态中具有预防作用，富含植物源a-亚麻酸的亚麻籽油通过类固醇激素微生物群炎症轴改善多囊卵巢综合征，硬脂酸（FA 18:0）可以降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。高脂饮食导致体内脂质代谢紊乱，脂肪酸含量异常增加，在脂肪组织中诱导显著的炎症反应，并向体内分泌炎症标志物，如肿瘤坏死因子A，进一步加重肥胖。蛋白质组学和代谢组学的结果表明，MSS的干预促进了大鼠肝脏中的脂质代谢，消耗了高脂饮食带来的过量脂肪酸氧化产生能量，使脂肪酸含量恢复到正常饮食水平，改善了高脂膳食引起的体内脂质代谢紊乱。此外，蛋白质组学结果还显示，PCK1在丙酮酸代谢，BHMT、GNMT在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢中的表达减少。当PCK1的过度表达导致葡萄糖输出增加和糖尿病恶化，而PCK1缺失导致致命低血糖时，PCK1将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸，后者通过糖异生过程进一步生成葡萄糖，是糖异生的关键酶，尤其是在肝脏和肾脏中。PCK1的下调可能导致丙酮酸的积累。丙酮酸是能量代谢过程中的关键物质。在线粒体中，丙酮酸和NAD+被转化为乙酰辅酶A、NADH和二氧化碳，最后通过氧化磷酸化转化为ATP，乙酰辅酶A和草酰乙酸通过柠檬酸合成酶的作用被转运到细胞质中，产生柠檬酸用于丙酮酸的再合成。BHMT和GNMT是甜菜碱代谢为甘氨酸的关键蛋白，下调导致甜菜碱水平升高。甜菜碱已被证明可以减少大鼠肝脏脂肪积累，改善胰岛素抵抗，并减少肝脏脂肪变性。MSS的干预可能通过限制丙酮酸代谢过程中的关键酶PCK1来调节丙酮酸代谢，限制糖异生过程，同时增加肝脏中甜菜碱的量，改善高脂饮食喂养的大鼠肝脏中的代谢。总之，本研究提示MSS干预可能通过上述生物学过程促进单纯性肥胖大鼠肝脏的脂质代谢，通过减少脂质沉积，调节丙酮酸代谢等生物过程，调节丙酮酸代谢等生物过程，可改善肝脏代谢紊乱，使肝脏在一定程度上恢复到正常饮食大鼠的水平。MSS是一种传统食品，是贵州饮食模式的主要组成部分。它在中国贵州省黔东南地区已经被食用了100多年。这项研究发现，MSS可能对高脂肪饮食引起的单纯性肥胖有预防作用。这项研究的结果可能为寻找预防肥胖的新健康饮食模式提供方向和理论依据，我们将通过体外实验和人群调查进一步验证这一点。https://www./articles/10.3389/fnut.2022.1019205/full
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