|
文章整理自国家卫健委临床检验中心 李金明 教授的专题讲座 自1953年Watson与Crick发现DNA双螺旋结构以来，一系列分子生物学新技术相继出现，如:Sanger测序、放射性核素和非放射性核素标记技术、电泳、层析、核酸纯化、核酸液相和固相杂交、基因工程技术、限制性酶切、毛细管电泳、PCR、基因芯片、质谱、新一代测序等。这些技术为临床分子诊断发展,提供了源源不断的动力和无限的想象空间，并在应用中不断成熟，使得分子诊断技术成为检验医学中最具活力一个的领域。随着分子诊断技术的快速发展，其在诸多疾病诊疗中也正发挥着越来越重要的作用，逐步迈入个体化医学时代。 目前，临床分子诊断相关的方法流程中几乎都存在基因扩增环节，尽管相关主管部门从2002年开始就对临床基因扩增检验实验室进行规范化管理，提出质量保证要求，但仍存在SOP可操作性差、仪器维护校准不到位、室内质控开展过程的形式化等质量问题。 分子诊断的质量管理核心及方法 检验医学为疾病的诊断、治疗、康复和预防提供实验室依据，临床检验质量对于检验医学的重要性不言而喻。那么，分子诊断的质量管如何从“难”变“易”？ 现阶段，临床分子诊断具备快、多、广、高四大特点。“快”意为“发展快”，从单个基因或单个DNA、RNA分子检测的1.0时代，现在已发展到多基因检测的2.0时代、多组学分析（基因组、转录组、蛋白质组等）的3.0时代；“多”意为“方法多”，包括了荧光PCR、PCR-杂交法、PCR-测序、PCR-SSCP、质谱、微流控芯片等；“广”意为“应用广”，分子诊断目前已经应用与病原微生物、药物基因组学、肿瘤靶向和免疫治疗、产前筛查和诊断、遗传病、罕见病等领域；“高”意为“要求高”，技术的快速发展，自然对人员、质量管理、实验室环境及仪器设备等均提出了更高要求。 质量管理的本质即为过程的管理。通常将过程控制划分为分析前质量控制（申请单、患者准备、采血标本、标本存放和运送等）、分析中质量控制（标本测定、结果计算等）、分析后质量控制（检验结果的发出至临床应用）。众所周知，影响临床检验质量的五要素为“人、机、料、法、环”，其中，“人”是关键，“法”就是SOP（标准操作程序），并不是常被人认为的“检测方法”。 目前，几乎每个实验室都在做质量控制，但更多的是室内质控和室间质量评价，除了这两点外，质量控制措施还应包括使用人员比对、方法比对、仪器比对等进行复现性检测；分析不同检测结果的相关性；通过常规数据变化、监控检测、校准的有效性等，此外还有非常重要的一点就是对留样进行在检测。 性能验证在分子诊断质量控制中的重要性 近年来，为加强新冠病毒核酸检测能力建设，各地新建和改扩建的PCR实验室数量快速增长。但仍发现很多实验室对性能验证相关知识并不是很了解。其实，性能也正也是实验室质量控制的重要环节。 在IS015189相关文件中，对性能验证的概念描述为“在常规应用前，应由临床实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。实验室进行的独立验证，应通过获取客观证据（以性能特性形式）证实检测程序的性能与其声明相符。验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关”。简而言之，对于新开展的检测项目，实验室需要在本实验室特定条件下复现商品化试剂说明书中所列出的相关性能指标，如符合率、精密度和灵敏度等。 在《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》中指出，在用于临床标本检测前，实验室应对由提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》中PCR定性检测选择验证的性能指标也包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。实时荧光定量PCR检测新冠核酸病毒一般需要验证符合率、检出限和精密度。数据显示，在全国室间质评中使用最多的核酸检测方法为实时荧光RT-PCR。  需要进行性能验证的情况 分子诊断检验程序的性能参数主要包括 PCR 定性和定量检测、Sanger 测序、二代基因测序(NGS)和原位杂交等。PCR 定量检测选择验证的性能指标宜包括测量正确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含抗干扰能力）、分析灵敏度、检出限和定量限、线性区间（可报告区间）等。PCR 定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。 Sanger 测序和 NGS 选择验证的性能指标宜包括方法符合率和检出限等。原位杂交技术应依据样本类型和预期用途，选用适宜的性能指标进行验证，如基于完整细胞的原位杂交宜选用分析敏感性和特异性，基于组织的宜选用方法符合率。 当然，除上述提到的符合率、精密度和检出限等性能指标外，实验室还可根据自身情况对试剂说明书中的其他性能指标进行验证，如交叉反应和抗干扰能力等，不过目前这些并不是强制要求。 分子诊断实验室在以下情况下应开展性能验证： 第一，检验程序常规应用前； 第二，任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后，应在检测系统重新启用前对受影响的性能进行部分性能验证。现用检测系统的任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更，如试剂升级、仪器更新、校准品溯源性改变等应按照新系统来进行验证； 第三，常规使用期间，实验室可基于分析系统的稳定性，利用日常工作产生的检验和质控数据，定期对检验程序的分析性能进行评审，应能满足检验结果预期用途的要求。  综上所述，实验室质量控制对于检验结果的准确性会产生很大影响，为保证实验室检测质量的精准，检验人员务必认真对待质量控制、性能验证等诸多环节，严格遵守相关规范，以最大限度地保证自身实验室检测结果的准确可靠。 |
|
|
