复制的，留着备用。看的懂的，觉得别人写的不好（不通俗易懂）。看不懂的，以后慢慢摸索。 肺癌细胞系（A549细胞和H1975细胞）培养和转染病毒 细胞复苏 (1)将DMEM培养基放入超净台中，打开紫外灯消毒30min。 (2)从液氮罐中取出冻存的肺癌细胞系(A549细胞和H1975细胞)，并将其放入37度恒温水浴锅中溶解。 (3)取出溶解好的细胞悬液，加入等体积的DMEM培养基，用移液器吹打混匀后将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm，离心5 min； (4) 向细胞培养瓶中加入相应体积的DMEM培养基，弃去步骤(3)离心管中的上清液，加入lmL（加入太多不好吹打细胞）的DMEM培养基，用移液器混匀细胞悬液。 (5)将细胞培养瓶置于37度恒温细胞培养箱中，培养24h后可考虑换液。 细胞换液 (1)将DMEM培养基放入超净台中，打开紫外灯消毒30min。 (2)取出细胞，光镜下观察细胞生长状态、有无污染等。 (3)DMEM培养基弃掉，PBS溶液清洗细胞2~3次后，加入3-4ml的DMEM培养基（具体加入多少，看培养瓶的大小），放回细胞培养箱中继续培养，待细胞生长密度达到80~90％后，可行细胞传代培养。 细胞传代 (1)DMEM培养基紫外灯消毒30min。 (2)取出细胞，光镜下观察细胞生长状态，确定细胞生长密度达到80~90％后可行传代操作。 (3)弃培养基，PBS溶液清洗细胞3-5次后，向细胞培养瓶中加入1ml的0.25％Trysin.EDTA（胰酶）消化细胞。胰酶的体积根据培养瓶决定，胰酶的浓度，质量好的0.05%的浓度就可以消化细胞。一般消化2~5分钟，一般放在培养箱中消化。 (4)光镜下观察细胞形态变成圆形后（消化成功），加入等体积的DMEM培养基终止消化（要尽快终止消化，消化时间长了细胞会死掉）；用移液器重悬细胞，并将细胞悬液移入离心管（用多大的离心管，根据实验室条件决定），放入离心机中，1000rpm，离心5min。 (5)将离心管中的上清液弃去后加入1mL的DMEM培养基，用移液器混匀后将细胞悬液移入细胞培养瓶中（一般1:3传代，就是相同大小的培养瓶，一瓶分成3瓶），向培养瓶中加入DMEM培养基后，将其放回37度细胞培养箱中。 细胞冻存 (1)培养基紫外灯消毒30min。 (2)细胞生长密度达到80~90％可行细胞冻存。 (3)弃培养基，用PBS溶液清洗细胞3~5次，向培养瓶内加入1ml的0．25％Trysin．EDTA消化细胞。 (4)光镜下观察细胞形态变圆后，加入等体积的DMEM培养基终止消化；用移液器重悬细胞，放入离心机中，37度，1000 rpm，离心5min，弃上清。 (5) 向细胞中加入冻存液，用移液器吹打均匀后，将细胞悬液移入冻存管中，冻存管置于冻存盒中梯度降温，将其放入零下80度冰箱过夜，取出细胞放入液氮罐中长期保存。 转染病毒 (1)培养细胞，细胞生长密度达到80％~90％时可进行后续实验。 (2)用0．25％Trysin．EDTA消化细胞，并用血球计数板计数，以1×10e5cells／孔的密度将细胞接种于6孔板，向每孔中加入500ul的病毒液(构建好的sh．Ctrl和sh．基因慢病毒质粒)，8h后更换新鲜的DMEM培养基。 (3)待细胞生长密度达到80％~90％时，更换新鲜的DMEM培养基，并向其中加入嘌呤霉素药杀72h。 (4)荧光显微镜下观察病毒侵染效率，更换新鲜的DMEM培养基，待细胞生长密度达到80％~90％时，采用qRT-PCR实验验证细胞敲低效率。 步骤3和步骤4，感觉重复了，不知道要搞什么灰机。 细胞RNA提取 (1)弃培养基，用PBS溶液清洗细胞3~5次清洗，加入1ml Trizol裂解液，置于冰上裂解30min后，用细胞刮刀将细胞刮下移入EP管中。注意，细胞刮刀不能有RNA酶。 (2)每EP管中加入200ul的三氯甲烷，震荡机上震荡并充分混匀，室温静置5min后，放入离心机，40C，12000rpm，离心15min。 (3)吸取上层水相并将其转移至EP管中，向EP管中加入等体积的异丙醇并混匀，将其入4度冰箱中2h或者-20度冰箱中24h。 (4)将EP管取出后放入离心机中， 4度离心，15min；EP管中的上清弃去，用75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀下来的RNA，重复3~5次； (5)将EP管放入离心机中，7500rpm，4度，离心5min，弃去上清后将EP管倒扣在吸水纸上放置15min。 (6)向EP管中加入DEPC水，并将其置于冰上溶解15min。 (7)用NanoDrop仪测量RNA的吸光值，并计算RNA浓度，将RNA样品放到-80度冰箱保存或者进行后续实验。
在B战看了视频才知道，要用5个96孔板，分别培养12345天，分别做CCK8实验。
 最喜欢粤语翻译。  |
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