【原】外泌体作为新冠患者的无细胞疗法：真正的机会和前景

干细胞与外泌体 2023-01-05 发布于广东

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目前还没有市售的有效抗病毒药物或疫苗来应对新型冠状病毒病 (COVID-19)。因此，对于 COVID-19 的新的有效治疗方案存在大量未满足的医疗需求。大多数 COVID-19 死亡是由急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 引起的。这种病毒会引起过度和异常的炎症，因此尽快控制炎症很重要。迄今为止，大量研究结果表明，间充质干细胞及其衍生物具有抑制炎症的作用。外泌体充当细胞间通讯工具，在细胞之间转移生物活性分子（基于它们的来源）。最近用于治疗 COVID-19 的基于外泌体的临床试验，潜在的治疗可能包括以下项目：首先，使用间充质干细胞分泌蛋白组。其次，将特定的 miRNA 和 mRNA 整合到外泌体中，最后，使用外泌体作为载体来递送药物。

新冠肺炎

新型冠状病毒病 2019 (COVID-19) 是冠状病毒科的一种包膜 RNA 病毒，于 2019 年底在中国武汉首次发现，并宣布为全球公共卫生紧急事件。世界卫生组织 (WHO) 将病毒相关疾病命名为 SARS-CoV-2 。

人与人之间的传播通过呼吸道飞沫或接触受污染的表面发生。潜伏期平均为 5 天，从 1 天到 14 天不等。该病毒通过直接或间接接触传播。在直接接触中，病毒像握手一样在人与人之间传播。间接地，传播通过污染物发生，例如纸巾或受污染的表面。空气传播也可以在没有身体接触的情况下传播病毒。通过打喷嚏和咳嗽，飞沫可以直接感染人，或者吸入空气中的微小气溶胶也可以使人感染这种病毒。

大多数患者有轻度呼吸道感染，伴有发烧和咳嗽。然而，在某些人中，感染 Covid-19 可能没有症状，这可能与病毒的传播有关。超过一半的患者没有症状，但有 CT 和实验室检查结果异常。

据称，与年轻患者相比，老年患者在 ICU 入住率方面有更严重的症状。肥胖和糖尿病等基础疾病会导致年轻患者入住 ICU。

然而，市场上没有有效的抗病毒药物或疫苗来应对这种紧急情况。一旦感染，患者主要依靠免疫系统抵抗SARS-CoV-2，如果出现并发症则给予支持治疗。SARS-CoV-2 可以通过其刺突蛋白受体结合域 (RBD) 与血管紧张素 I 转换酶 2 受体 (ACE2) 结合进入细胞。

这种病毒诱导过度和异常的宿主免疫反应，通常伴随着促炎细胞因子的过度产生，包括 IL-2、IL-6、IL-7、GSCF、IP10、MCP1、MIP1A 和 TNF。通过靶向肺组织，这些细胞因子会诱发肺水肿和随后的急性肺损伤 (ALI) 或急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)。因此，迫切需要引入适当的治疗方法来抑制细胞因子风暴和肺修复功能。

间充质干细胞 (MSC) 具有多种特性，使其成为 COVID-19 治疗的潜在候选者：这些细胞可以调节免疫反应，减少炎症，从而在 ALI 和 ARDS 期间保护肺泡上皮细胞。

此外，由于特定细胞因子的存在，MSCs 可以抑制病毒感染。迄今为止，已有多项研究提出使用 MSCs 治疗 COVID-19 肺炎，中国西安交通大学第二附属医院的一项研究表明，静脉移植hUC-MSCs是治疗重症COVID-19的一种有效且安全的方法。

他们的结果表明，hUC-MSC 治疗组的临床改善时间比对照组短。此外，hUC-MSC治疗组的28天死亡率为0，而对照组为10.34%。很少有研究关注干细胞分泌蛋白组，如细胞外囊泡 (EV)。

在美国纽约大学格罗斯曼医学院的一项研究中。来自同种异体骨髓间充质干细胞 (ExoFlo) 的外泌体被用于治疗 SARS-CoV-2 PCR 阳性患者。他们接受了单次 15 mL 静脉注射剂量的 ExoFlo，并在治疗后 1-14 天评估了安全性和有效性。结果显示存活率为 83%。71% 的患者康复，13% 的患者虽然病情稳定但病情仍然很严重，16% 的患者因与治疗无关的原因死亡。此外，实验室结果显示中性粒细胞和 CD3+、CD4+ 和 CD8+ 淋巴细胞数量显着改善，C 反应蛋白 (CRP) 和铁蛋白下降。

MSCs 衍生的外泌体

外泌体是由脂质双层包裹的细胞外囊泡之一。基于它们的主要来源，外泌体携带复杂的货物，包括核酸、microRNA、脂质和蛋白质等生物活性分子，它们被传输到邻近和远处的细胞，从而改变受体细胞的命运。

已经开发了多种提取外泌体的方法，例如离心系列然后高速超速离心。在此过程中，外泌体的分离基于连续分离的质量、形状和大小。这种方法的优点之一是降低成本和降低污染的机会，但它无法区分外泌体和其他小囊泡或大蛋白质聚集体。

另一种方法是梯度超速离心法，它可以高产率地分离出保留其功能的外泌体，但与尺寸排阻色谱法相比，这种方法的特异性较低。大小和蛋白质标记是外泌体表征的最重要特征。可以使用扫描电子显微镜 (SEM)、透射电子显微镜 (TEM) 和纳米粒子追踪分析 (NTA) 检测外泌体。此外，生化表征可以揭示外泌体蛋白的共同特征。最丰富的蛋白质是 CD9、CD63、CD81 和 CD82)、MHC 分子、14-3-3 蛋白质、热休克蛋白 (HSP) 和 Tsg101。

正如科学家最近研究结果表明，外泌体由于其独特的传递和交换细胞内化学信息以及与受体细胞相互作用的能力，外泌体已越来越多地应用于多种疾病的治疗(图1 )。

图1：外泌体在多种疾病中的几种治疗应用

截至目前，全球约有7项使用外泌体治疗

的临床试验正在进行中（表1）。研究表明，外泌体治疗 COVID-19 的潜力可分为三大类。首先，使用不同来源的间充质干细胞分泌的外泌体颗粒代替细胞疗法。其次，最后将特定的 miRNA 和 mRNA 整合到外泌体中，使用外泌体作为载体来递送治疗 COVID-19 的药物。

表1：用于治疗 COVID-19 的基于外泌体的注册临床试验清单

3. 使用间充质干细胞分泌组

然而，现在很清楚 MSCs 通过旁分泌机制发挥作用。MSC-secretome 由细胞外囊泡和几种可溶性蛋白质、细胞因子、趋化因子和生长因子组成。这种分泌蛋白组可以与靶细胞相互作用并通过内源性干细胞激活、细胞凋亡抑制、调节炎症反应、纤维化减少和介导趋化作用来改变受体细胞的命运。

多项研究表明，MSCs 分泌蛋白组的治疗效果如抗炎、再生、免疫调节促血管生成和抗蛋白酶特性，与起源的 MSCs 相似。

因此，这种从 MSCs 中提取的条件培养基可以被认为是治疗肺部疾病的一种有前途的无细胞治疗工具。一项研究结果表明，静脉输注间充质干细胞会导致外周淋巴细胞增加、某些类型的 T 细胞过度激活以及 C 反应蛋白减少。

在临床前的 ARDS 中，MSCs 分泌蛋白组在体内和体外的疗效都很明显，例如静脉注射后分泌蛋白组分布在双肺，血流稳定性高。

值得注意的是，在治疗中使用外泌体比 MSCs 有更多的好处。外泌体比 MSC 更小、更简单，因此生产和储存更可行。此外，它们没有自我复制的能力，因此降低了内源性肿瘤形成的风险。此外，它们在静脉注射后表现出低免疫原性效应和低栓塞形成，因此它们比常规 MSCs 更安全，最终使用 MSCs secretome 的成本将远低于单克隆抗体疗法，这在大流行病治疗中非常重要。

意大利帕维亚大学的科学家Bari 及其同事首次建议可以将 MSC-secretome 配制成吸入雾化药物/EV。通过吸入施用 MSC-secretome 可以改善临床结果。从本质上讲，这种给药途径是一种无创方式，副作用较少，可以使较低的剂量具有与注射或口服治疗相同的效果。

根据现有证据，MSC-secretome 被制成用于静脉内或吸入使用的冻干粉，似乎是治疗 COVID-19 肺炎患者的合适候选药物。在这方面，最近在http://www.上进行了两项临床试验。一个研究小组 ( NCT04276987 ) 目前正在研究吸入来自同种异体脂肪间充质干细胞的外泌体用于治疗 COVID-19 肺炎和 ( NCT04313647 )，评估它们在看起来健康的志愿者中的安全性和耐受性。请参阅表1更多细节。

4. 将特定的 miRNA 和 mRNA 纳入外泌体

病毒在受感染细胞中复制的机制是使用核酸和蛋白质合成系统。动物细胞中的蛋白质合成受微小 RNA 或 miRNA（抑制 mRNA 的 RNA）的调节。miRNA 是一类小的非编码 RNA，通过与相关 mRNA 的非翻译区相互作用来调节靶基因的 mRNA 。

由于病毒蛋白合成发生在宿主细胞中，因此 miRNA 的这种调节功能可用于对抗病毒性疾病。为此目的使用 miRNA 需要与病毒基因组 (gRNA) 的 mRNA 或其编码蛋白质的部分基因组完美或接近完美匹配。这种结合导致目标基因的切割和降解。

因此，为了尽量减少副作用，选择与病毒基因组特异性结合的 miRNA 序列非常重要。人类基因组的互补序列可以包括非特异性基因沉默。有几个强大的程序可以识别和预测 miRNA 的基因靶点，例如 MirTarget、MiRanda、TargetScan 和 PicTar II。

与 60 岁以上的成年人相比，15 岁以下的儿童感染 SARS-CoV-2 的频率较低这一事实的可能解释是，piwi 相互作用 RNA (pi-RNA) 和 miRNA 的表达具有年龄依赖性现象，事实上 pi-RNA 表达随着年龄的增长而减少，而 miRNA 表达增加。似乎在个体发生过程中，一种或多种可与病毒 gRNA 结合的 pi-RNA 的表达减少。同样，能够与 gRNA 结合并在个体发育早期表达的 miRNA 浓度可能会降低，病毒开始繁殖。

5. 用于药物输送的外泌体

在长距离细胞间通讯中，外泌体非常重要，因为它们可以进入循环并穿过额外的生物屏障。最近的证据表明它们可以在细胞之间携带丰富的货物。

由于外泌体的特殊结构，可以将各种药物插入其中，因此它们可以作为药物输送系统用于多种疾病。此外，在个性化医疗中，外泌体可以从患者的血浆中分离出来，然后填充外源性感兴趣的药物，最后还给同一患者。MSCs 外泌体的免疫调节货物与抗病毒药物相结合，使其成为治疗该疾病的新型干预工具。用于治疗 Covid-19 患者的 Remdesivir 抗病毒药物可以加载到外泌体中。然而，就 COVID-19 而言，必须进行更多的审查，以充分了解抗逆转录病毒药物向靶组织的安全性、特异性、熟练程度和递送机制。

总之，为了克服 COVID-19 的大流行，我们需要制定多方位战略以尽量减少其流行。在这种感染中，严重的细胞因子风暴是器官损伤的主要原因，MSCs不仅抑制细胞因子风暴，而且由于其强大的免疫调节能力，促进内源性再生机制。除了MSCs，其衍生物包括外泌体也具有作为一种治疗技术赢得了相当大的兴趣。基于外泌体的治疗是一种有吸引力的策略，可以实现 MSC 的治疗益处，同时不会给患者带来并发症和细胞困难。特别是，在临床前模型中可能使用外泌体来缓解 ARDS 是众所周知的。

（本文作者Leila Rezakhani等来自克尔曼沙赫医科大学，原文标题Mesenchymal stem cell (MSC)-derived exosomes as a cell-free therapy for patients Infected with COVID-19: Real opportunities and range of promises，2021年发表在Chem Phys Lipids ）

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间充质干细胞外泌体的临床应用系列：

MSCs-Exo系列一 | 间充质干细胞外泌体在免疫调节中的作用（点击链接）

MSCs-Exo系列二 | 间充质干细胞外泌体在皮肤再生中的应用（点击链接）

MSCs-Exo系列三 | 间充质干细胞外泌体在神经损伤中的应用（点击链接）

MSCs-Exo系列四 | 间充质干细胞外泌体在肝损伤中的应用（点击链接）

MSCs-Exo系列五 | 间充质干细胞外泌体在肾损伤中的应用（点击链接）

MSCs-Exo系列六 | 间充质干细胞外泌体在脑卒中中的应用（点击链接）

MSCs-Exo系列七 | 间充质干细胞外泌体在糖尿病中的应用（点击链接）

NK细胞在肿瘤免疫治疗中的应用系列：

免疫治疗系列一 | NK细胞在白血病治疗中的应用（点击链接）

免疫治疗系列二 | NK细胞在肝癌治疗中的应用（点击链接）