【原】【Hortic Res】miR390b的过表达可促进杨树茎的伸长和高度生长

文章信息

题目：Overexpression of miR390b promotes stem elongation and height growth in Populus

刊名：Horticulture Research

作者：Xueping Shi，Qiaofang Shi et al.

单位：Huazhong Agricultural University

日期：21 November 2022

01

摘要

MicroRNA390 (miR390) 通过下调下游基因反式作用短干扰 RNA3 ( TAS3 ) 和AUXIN RESPONSE FACTORs ( ARFs ) 的表达参与植物生长发育。miR390-TAS3-ARFs通路参与杨树茎发育的研究较少。

在这里，通过小 RNA 测序分析筛选了杨树茎发育过程中差异表达的 miRNA，并揭示了 miR390b 在茎发育中的新功能。miR390b (OE-miR390b) 的过表达导致木质部纤维细胞数量的大量增加和纵轴处细胞长度的轻微减少。在 OE-miR390b 植物中观察到茎伸长和植物高度的总体增加。

根据转录组测序结果和瞬时共表达分析，TAS3.1和TAS3.2被鉴定为杨树miR390的靶基因，并在顶端受miR390负调控。ARF3.2和ARF4的转录水平在 OE-miR390b 植物中受到显着抑制，并且与沿纵轴的木质部纤维细胞数量呈强烈负相关。这些发现表明，杨树中保守的 miR390 - TAS3 - ARFs通路与茎伸长和株高生长有关。

02

技术路线

9-year-old P. deltoides clones were grown at a field site in Huazhong Agricultural University (Wuhan, China)

sRNA-Seq analysis

Gene cloning and sequence analysis

Construction of expression vector and generation of transgenic lines

Gene expression assays

GUS staining

Length measurement and number estimation of fiber cell

RNA-Seq analysis

Transient co-expression assay

03

主要结果

3.1 干细胞发育过程中miRNA的鉴定和表达谱

为了研究茎发育的初级和次级生长阶段中差异表达的miRNA，根据毛白杨15中的转录组分析结果，选择9年的三角杨I-69×I-63（以下称为三角杨）的顶点（AP）、节间（IN）2-IN5和IN9作为sRNA Seq的样本（图1A和补充图1）。叶片（LF）作为对照。从21个sRNA文库中总共获得9207679至13121893个clean reads（补充表2）。

基于miRNA表达值的主成分分析（PCA）（补充数据集1）表明，AP、IN9和LF从IN2-IN5样品中明显分离（图1B）。样本比较之间共有75个miRNA差异表达（补充数据集2）。通过使用k均值聚类将每个生物复制中的miRNA表达模式聚类为7组，获得了三个生物复制中具有一致表达模式的40个差异表达miRNA（图1C）。在差异表达的miRNA中，有四种（包括miR159c、miR171a-5p、miR171e/f/g-3p/h-3p/i和miR390a-c/d-5p）、六种（包括iR160b-3p/c-3p、miR172h-5p、iR172d-e、miR172g-3p/h3p、miR168a-3p/b-3p和miR6427-3p）和七种miRNA（包括miR164a-e、miR2111a/b、miR390d-3p、iR394a-5p/b-5p、micro396a/b、micro396c/d/e-5p和miR3967-3p）f）在AP中高度表达，从初级生长到次级生长的转变（IN2-IN5）和IN9。这些miRNA在调节干细胞发育中具有潜在的重要作用。

miR390a-c/d-5p在AP中具有高表达水平，并进行了进一步研究。在杨树基因组中，四个MIR390基因（MIR390a-d）产生了五个MIR390成熟序列（MIR390a-c、miR390d-5p和miR390d-3p）。在这些序列中，miR390a-c和miR390d-5p的成熟序列是相同的。

随着对AP中高表达miRNA的关注，成熟miR390a-c/d-5p的表达模式通过RT-qPCR验证，其在AP样品中也表现出高表达（图1D）

图1三角杨I-69×I-63茎发育过程中小RNA测序和差异表达miRNA的样品。

（A） sRNA序列的AP、LF、IN2、IN3、IN4、IN5和IN9采样。采集长度为2mm的节间样本。比例尺为2cm。

（B）AP、IN2-IN5、IN9和LF样本中miRNA的PCA。

（C）17种在干发育过程中差异表达的miRNA和23种在LF中高表达的miRRNA的热图。样品名称中的T1至T3表示样品的三个生物复制。使用R中的pheatmap包以比例TPM绘制表达量。

（D）通过RT-qPCR在不同样品中积累成熟miR390a-c和miR390d。

3.2 miR390b在杨树中普遍存在

miR390家族有来自163种植物的374个成员34，其中306个成员共享相同的成熟序列（5'-AAGCUCGAGGAUAGCGCC-3'，作为miR390的标准成熟序列），如序列标志所示（图2A）。

在这些序列中，杨树中miR390a-c/d-5p的成熟序列与标准序列一致。初级转录物的RT-qPCR显示了四个MIR390基因，在三角杨中具有不同的表达模式。Pri-miR390a/b/d在AP和IN9中高度表达，而Pri-miR390c在IN9中特异性表达（补充图2）。

本研究以miR390b为研究对象。基于miR390b前体序列，通过5'RACE和3'RACE获得miR390b初级转录物的全长。MIR390b的全长转录物和相应的DNA序列均为584bp，表明三角肌的MIR390b中没有内含子（补充图3）。转录起始位点位于成熟miR390b上游89 bp，miR390b位于三角豆基因组的06号染色体（Chr06）上（图2B）。尽管miR390b的前体在不同的杨树品种中不太保守，但所有前体都产生了相同的成熟序列（图2C）。从不同组织的tremula×P.alba INRA克隆7171-B4（以下称为717杂交杨）中提取RNA并进行质量分析（补充图4）。717杂交杨的初生根（PR）和叶柄（PT）中miR390b的表达水平较高，而幼茎（YS）和成熟叶（ML）中表达水平较低，尤其是幼叶（YL）和AP（图2D）。

为了进一步了解MIR390b的表达模式，将由MIR390a启动子驱动的GUS构建体转化为野生型（WT）717杂交杨树。GUS染色在6-8周龄组织培养幼苗的AP和YL以及YS中检测到，也在ML的主静脉、LR的原基以及LR和PR的血管组织中检测到（图2E）。此外，在主根尖（PRT）中检测到微弱的GUS染色，而在侧根尖（LRT）中没有染色（图2E）。在6至8周龄的土壤培养植物中，在第3叶柄（PT3）的表皮毛状体和表皮细胞以及初生木质部导管中检测到GUS染色（图2F）。在PT9的表皮细胞中也观察到miR390b的表达，但在PT15中没有观察到（图2F）。从IN3到IN9，miR390b在干的表皮细胞中的表达逐渐减少，最终无法检测到（图2F）。

随着茎次生生长的过渡，miR390b的表达在初生木质部中逐渐增加，甚至在IN15的髓射线中也逐渐增加（图2F）。随着杨树的生长，组织中miR390b的表达以逐渐的方式持续变化，反映了其时空特异性

图2 miR390b的序列保护和表达模式。

（A） 来自163种陆地植物的miR390成熟序列的保护。序列标志中每个位置的大写字母的高度表示保护程度。

（B） MIR390b基因在杨树基因组中的定位。蓝色框表示MIR390b基因的全长，橙色框表示MIR390b前体，红色框表示成熟的MIR390b。

（C） 不同杨树品种中miR390b前体的序列比对。红色框表示成熟miR390b的序列。

（D） 通过RT-qPCR检测miR390b在WT不同器官中的表达水平。LR，侧根；PR，主根；OS，旧茎；YS，幼茎；PT，叶柄；ML，成熟叶；YL，幼叶；AP，顶点。

（E和F）含有由MIR390b启动子驱动的GUS报告基因的转基因杨树的组织化学染色。6至8周龄的组织培养幼苗（E）和6至8周龄的土壤培养幼苗（F）用于GUS染色。LRT，侧根尖；PRT，主要根尖。

3.3 miR390b的过度表达促进杨树茎伸长

为了确定miR390是否参与杨树的AP发育，用过表达（OE）miR390b的载体转化WT 717杂交杨树进行表型观察和鉴定（补充图5A）。在获得的9个独立OE-miR390b系中，miR390b的表达水平在叶片中上调（补充图5B和C）。

其中，选择了前体和成熟miR390b表达水平显著上调的三个OE-miR390b系（即OE-42、OE-44和OE-65）用于后续实验（图3A和补充图5D）。将WT和OE-miR390b系移入温室生长后，发现OE-miR290b系高于WT植物（图3B）。每周在固定时间测量植物的生长数据，结果表明OE-miR390b系从顶点到节点10的长度比WT长约30%（图3C）。尽管与野生型相比，OE-miR390b株系每月的高度增长和节数增量没有一致的显著差异（补充图6A和B），但高度与节数的月增长率显著增加（图3D）。

此外，OE-miR390b株系中株高与节点数之比的显著增加是由株高的显著增加而非整个植株总节点数的增加引起的（补充图6C-E）。具体而言，从IN5到IN10的OE-miR390b株系的每个IN长度都显著长于WT（图3E和F），基部直径和IN直径没有显著差异（补充图6F和G）。OE-miR390b品系和WT之间的叶形态、叶面积和叶长宽比没有显著差异（补充图7A-C）。

此外，在根形态、根干重和根鲜重方面没有观察到显著差异（补充图7D-F）。杨树的IN长度由两个因素决定：细胞数量和沿树干纵轴的细胞长度。基于上述因素，在横截面中观察到土壤培养植物中维管组织的发育，并在纵截面中测量木质部纤维细胞（已经历细胞壁增厚）的长度（图3G和H）。OE-miR390b系中IN4的血管发育状态与WT中IN6的血管发育状况基本相似，所有OE-miR290b系和WT的IN7中都发生了木质部纤维细胞的二次生长（图3G）。

IN8的木质部纤维细胞长度的测量和统计分析表明，OE-miR390b系中的木质部细胞长度比WT短7-10%（图3H和I）。然而，OE-miR390b系中IN8木质部纤维细胞在纵轴上的相对数量比WT高37-47%（图3J）。这些结果表明，miR390的过表达促进了茎的伸长和植株的高度，并增加了木质部纤维细胞在纵轴上的数量。

图3 miR390b的过度表达促进了杨树的茎伸长。

（A） 成熟miR390b在4周龄组织培养的WT幼苗和过表达miR390b的系（OE-miR390b）的叶片中的表达水平。PtActin作为内源性控制基因。

（B） WT和OE-miR390b系的形态学表型。与野生型相比，OE-miR390b系在温室中表现出较高的株高。

（C和D）WT和OE-miR390b线从顶点到节点10的长度和从高度到节点数的月增长的统计分析。

（E） WT和三个OE-miR390b系从顶点到节点10的形态学观察。黄色实线表示节点的位置，黄色虚线连接的节点是WT和OE-miR390b线之间的对应节点。比例尺为1 cm。

（F）WT的节间长度和（E）中IN3至IN10的三条OE-miR390b线。

（G） 用0.05%甲苯胺蓝染色的血管组织的组织学分析。横截面取自WT和OE-42的IN3至IN7。Ca、形成层；韧皮部；Xy，木质部；

（H） WT和OE-miR390b系IN8纵切面的组织学染色。黄色虚线表示木质部纤维细胞的两端。

3.4 在全基因组范围内鉴定对顶端组织中miR390过表达反应的基因

植物SAM通过侧器官的正常产生决定了茎节间纵向上的细胞数量，这随后影响了in的长度。为了探索miR390介导的干伸长的下游途径，比较了三个OE-miR390b系和WT的AP组织的转录组数据。

平均而言，每个样本的75%以上的clean reads与P.trichocarpa的参考基因组特异性比对（补充表3）。PCA的结果表明，三个OE-miR390b系与WT明显分离（补充图8）。

通过比较OE-miR390b系和WT之间的基因表达水平（补充数据集3），OE-42、OE-44和OE-65中分别有173、303和66个差异表达基因（DEG），其中47、76和16个基因表达上调，126、227和50个基因表达下调（补充数据集中4，图4A），表明每个OE-miR390b系中超过70%的DEG响应miR390b的过度表达而表达下调。

Venn图显示，在三条OE-miR390b线中共鉴定出388个DEG，但它们共有27个DEG（图4B和补充表4）。热图显示，在三条OE-miR390b线中，四个DEG上调，23个DEG下调（图4C）。这些结果表明，miR390b在杨树中的过度表达会影响相关基因的表达水平，并主要发挥负调控作用。

图4杨树顶端组织中对miR390b过表达反应的基因的鉴定

（A） OE-miR390b系和WT之间上调和下调差异表达基因（DEG）的数量。

（B）三个OE-miR290b系之间的重叠DEG。

（C） 三个OE-miR390b系中共表达DEG的聚类。

3.5 TAS3.1和TAS3.2是杨树miR390的靶基因

作为一种内源性非编码小RNA，miRNA通常通过切割下游靶基因的mRNA来调节植物生长和发育。因此，miR390靶基因的鉴定对于分析其调节茎伸长的功能具有重要意义。

四个TAS3基因，即TAS3.1（Potri.010G149600）、TAS3.2（Potri.008G101675）、TAS3.3（位于Chr18上）和TAS3.4（Potri0.002G191950），被鉴定为杨树34中miR390的候选靶点。在所述基因中，TAS3.2属于三个OE-miR390b系共享的DEG之一（图4C）。候选靶基因TAS3.1和TAS3.2高度同源，具有高度相似的序列结构（图5A）。与之前的报告34一致，杨树中第11个核苷酸的G:U摆动碱基对和第12个核苷酸在5'靶位点（TS）的错配，以及3'TS处的四个核苷酸的错配（图5A）。

为了验证miR390是否可以直接切割两个潜在靶基因的3'近端TS，使用了烟草叶片中的瞬时共表达（图5B-J）。与三个阴性对照组相比，与OE-miR390b+TAS3.1/TAS3.2-3'TS-GFP（即b+d/e）共注射的绿色荧光蛋白（GFP）荧光强度显著降低（图5C、e、G和i）。然而，与空载体+TAS3.1/TAS3.2-3’TS-GFP（即a+d/e）共注射的GFP荧光强度也明显低于其他两个阴性对照。在烟草中，miR390家族有三个成员（miR390a-c），其中miR390b和miR390c的成熟序列与杨树miR390a-c和miR390d-5p的序列相同，成熟miR390a与杨树miR390的差异仅在于3'近端的一个碱基差异（补充图9）。

因此，假设烟草miR390可能切割携带潜在靶基因3'近端TS的载体。因此，与STTM-miR390+TAS3.1/TAS3.2-3'TS-GFP（即c+d/e）共注射的烟草叶片的GFP荧光强度显著高于OE-miR390b+TAS3.1/TAS3.2-3'TS-GFP和空载体+TAS3.1/TAS3.2-1'TS-GFF（图5D，F，H和J）。结果表明TAS3.1和TAS3.2是杨树miR390的靶基因。

图5 miR390在体内直接切割TAS3.1和TAS3.2的验证

（A） 靶基因TAS3.1和TAS3.2的序列分析。红色序列表示与miR390互补的靶位点（TS）；蓝色下划线序列指示tasiaARF1；绿色下划线序列指示tasiaR2；橙色下划线序列表示tasiaF3。

（B） 烟草瞬时共表达中使用的载体的结构示意图。a、 空向量；b、 OE-miR390b载体；c、 STTM-miR390载体；d、 TAS3.1-3’TS-GFP载体，其过表达携带TAS3.1基因3’近端靶位点的GFP融合蛋白；e、 TAS3.2-3’TS-GFP载体，其过表达在TAS3.2基因3’近端携带TS的GFP融合蛋白；f、 携带TAS3基因的12个核酸突变位点的GFP融合蛋白的过表达载体；pri-miR390b，miR390b的初级转录物；STTM，短串联靶模拟；tas3基因的突变体tas3。

（C-F）将含有不同载体组合的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）共注射到烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的背面表皮下。b+d和b+e为实验组，其他组合为阴性对照。黄色虚线表示共注入区域。

（G和H）图C和D中GFP荧光强度的定量分析。

（I和J）图E和F中GFP的荧光强度的量化分析。

在WT中，TAS3.1的表达水平在PR和AP中显著更低，但在YS和ML中更高（图6A）。除YS和AP外，另一个靶基因TAS3.2在其他杨树组织中的表达水平较低（图6B）。

miR390b的表达在OE-miR390b系的不同组织中显著上调，尤其是在ML、YL和AP中，其比WT高100倍以上（图6C）。目标基因TAS3.1和TAS3.2在OE-miR390b系中表现出不同水平的下调表达（图6D和E）。TAS3.1在三个OE-miR390b系的LR、YS和YL中显著下调，在单个OE-miR319b系的PR、旧茎（OS）、ML和AP中显著下调（图6D）。

除了OE-42和OE-65在PR中的表达没有表现出一致的显著差异外，TAS3.2在三个OE-miR390b系的所有其他组织中显著下调，在AP中更下调（图6E）。这些结果表明，miR390b的过表达有效地抑制了靶基因TAS3.1和TAS3.2在杨树中的表达水平，而对TAS3.2的抑制作用在YS和AP中更显著。

图6 基因的转录水平和ARF表达水平与生长数据之间的共表达分析。

（A和B）靶基因TAS3.1（A）和TAS3.2（B）在WT不同组织中的表达模式。

（C-E）三个OE-miR390b系的不同组织中miR390b（C）和靶基因（D和E）的表达水平。WT作为对照。LR，侧根；PR，主根；OS，旧茎；YS，幼茎；PT，叶柄；ML，成熟叶；YL，幼叶；AP，顶点。

（F-J）通过RNA-Seq和RT-qPCR分析顶端组织中ARF的转录水平。

（K）5个ARF基因与OE-miR390b系三种表型之间的相关性分析。这三种表型包括IN长度、纤维细胞数量和纤维细胞长度。

（L） 提出的miR390/ARF3.2/ARF4调节杨树茎伸长的模型。miR390降解TAS3产生的tasiARFs对ARF3.2和ARF4的表达产生负调节，导致下游STM的表达上调。STM对侧枝器官的启动起负调节作用，导致木质部纤维细胞数量增加，进而导致茎伸长。

3.6 miR390-TAS3调控杨树ARF的预测

为了预测在杨树茎伸长过程中哪些ARF受到miR390-TAS3的下游调控，并通过加权相关网络分析（WGCNA）进行OE-miR390b表型与全基因组基因表达水平之间的相关性分析。

在基因组中，共有36个基因被注释为ARF蛋白。这些蛋白质序列的全长与来自拟南芥的ARF2、ARF3和ARF4蛋白质序列一起用于构建系统发育树（补充图10）。Potri.012G106100和Potri.015G105300的蛋白质与拟南芥ARF2属于同一分支，表明最高的相似性，分别称为ARF2.1和ARF2.2。同时，Potri.004G050150和Potri.011G059300的蛋白质与拟南芥ARF3属于同一个分支，Potri.0009G011800和拟南芥ARF4属于同一分支，分别称为ARF3.1、ARF3.2和ARF4。

尽管Potri.011G059101也被预测为ARF3/434，但由于与拟南芥ARF3/4的进化关系遥远，因此在下一项研究中省略了它。在miR390b过表达的影响下，通过RT-qPCR检测杨树中五种ARF的表达水平。结果表明，ARF2.2、ARF3.2和ARF4的转录水平在三个OE-miR390b系中被显著抑制（图6G、I和J）。尽管ARF2.1和ARF3.1的表达水平仅在个体OE-miR390b系中被显著抑制，但其他系中的表达水平也呈现下调趋势（图6F和H）。

ARF基因在RNA-Seq数据中的表达趋势与RT-qPCR的结果基本一致（图6F-J）。通过相关系数推测来自RNA Seq的基因表达水平与OE-miR390b系的多种表型数据之间的共表达关系，并筛选miR390促进茎伸长的下游关键ARF。鉴于miR390对ARF的负调节作用，重点研究了与IN长度和纤维细胞数量负相关、与纤维细胞长度正相关的ARF，粉红色模块中的ARF3.2和ARF4与上述三种表型最密切相关（图6K和补充图11）。结果表明，ARF3.2和ARF4对miR390b的过度表达做出反应，并与miR390协同参与杨树的茎伸长。

04

结论

miR390b的过表达可以促进717杂交杨树的茎伸长和高度生长。我们的结果表明，miR390b-TAS3.1/TAS3.2-ARF32/ARF4通路参与调节这些生物过程。miR390b-TAS3在调节树高生长中的参与为miR390家族在调节植物生长和发育中增加了新的功能，这对树木生物技术研究也具有重要意义。

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