miRNA她是谁？你是否也曾为她争论错与对——miRNA的qPCR检测

最近有同学在后台问科研狗miRNA用qPCR怎么检测，本文就来介绍下miRNA以及miRNA的qPCR检测

miRNA是什么？

miRNA是microRNA的简称，是一种长度为19-25nt的非编码调控单链小分子RNA，它的5’端带有磷酸基团，3’端带羟基，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体RISC降解mRNA或抑制其翻译。miRNA广泛存在于多种真核生物中，最早的miRNA是线虫中的let-7和lin-4。

命名上现在除了lin-4和let-7外，其他miRNA以miR+数字的形式表示，而mir+数字则表示对应的编码基因。

miRNA从哪里来？

1.细胞核内，由长的内源性转录本（pre-miRNA）生成70nt的具有茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA）.前体在转运蛋白exportin 5作用下从细胞核转移到细胞质。

2.在细胞质内，在Dicer作用下将pre-miRNA加工成为成熟的miRNA。

miRNA怎么作用的？

1.与靶mRNA的3‘端非翻译区UTR结合，这是一种非完全互补的结合。作用是阻止mRNA的翻译，影响蛋白质的表达，从而抑制基因表达，但是这种结合不能影响mRNA的稳定性。

2.与mRNA的翻译区结合，直接引起切割，有点类似于RNAi。

如何用qPCR检测miRNA?

我们通常采用qPCR方法来检测miRNA的表达水平，在前面N个章节里面我们介绍了许多qPCR的相关知识。其中最重要的是引物设计，接下来我们介绍下引物设计。

1

茎环引物

我们以has-miR-21为例来介绍茎环引物设计：

1.首先我们得到miR-21的成熟体序列，在http://www./网站上可以得到如下序列：

UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

2.茎环一般是通用的序列，我们采用的茎环序列如下：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

我们需要在这个茎环后面加上与miRNA互补的6个碱基，是步骤1中的成熟序列从后往前反向互补。既UGUUGA的反向互补：TCAACA。最后得到反转录的引物如下:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC tcaaca.

利用上述的RT反转录引物进行反转录。

3.qPCR引物设计

正向引物：每一个正向引物带有一段固定的序列（GGG），然后再这个序列后面加上成熟体除后面6个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面的6个碱基后序列为：UAGCUUAUCAGACUGA，把U变成T即可，最后的序列为：

5‘- GGG UAGCUUAUCAGACUGA -3’

反向引物：为一段固定的序列是茎环上面的一段序列：

5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’

2

oligo DT引物

oligo dT引物法是在miRNA后面先加上一连串的A，然后用oligo dT来进行逆转录，原理如下图所示：

oligo dT一般都有公司制备好相应的引物，包括反转录引物和qPCR引物，所以可以直接从公司购买。

如果你想自己设计qPCR引物检测，那么推荐用茎环的方法, oligo dT的方法可以从公司购买试剂盒，里面有专门的反转录引物以及qPCR引物。

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