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编译：微科盟口米嘻，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤，其侵袭性强、预后差。由于早期缺乏典型症状，大多胰腺癌患者被诊断时已是晚期甚至伴有转移，因此，胰腺癌的早期诊断对改善预后至关重要。目前，早期筛查常应用在高危人群，而充分了解胰腺癌的危险因素和发病机制，有助于我们识别高危人群，从而实现胰腺癌的早期诊断和及时治疗。近年来，尽管临床影像技术的检出率和内镜引导下细针穿刺术（EUS-FNA）的准确率均有所提高，临床上仍然还没有用于诊断胰腺癌的高灵敏性和高特异性的生物标志物。CA19-9因其特异性有限，不推荐作为胰腺癌的早期筛查。近年来，大量研究集中于发现可用于诊断胰腺癌的血清生物标记物，此外，循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、微小RNA、血液外泌体、尿液生物标志物、唾液等液体活检，在胰腺癌诊断中的应用也越来越受关注。人工智能、计算机辅助诊断系统、代谢组学技术、离子迁移谱（IMS）相关技术、新型纳米材料等创新技术均在胰腺癌的早期诊断中得以研究，这些诊断方式都有广阔的应用前景。本文综述了胰腺癌早期筛查和诊断方法的最新进展，包括影像学、病理检查、血清学检查、液体活检以及其它潜在的诊断策略。 论文ID 内容 1.介绍 胰腺癌由于其预后不良的特点，排列于全球癌症相关死亡病因的第七位，该病的年死亡数（n=466003）和年确诊数（n=495773）相差很小，预计到2030年，它将成为美国癌症相关死亡的第二大病因。与其它实体癌不同，过去几十年里，尽管其5年生存率略有提高，但仍不超过9%。由于早期缺乏典型症状，且侵袭性高，大多数胰腺癌患者确诊时即为晚期，已不适合接受手术治疗，导致其临床预后不佳。然而，当胰腺癌患者的肿瘤还局限于导管上皮且肿瘤小于1cm时，其接受治疗的5年生存率可达100%，因此，胰腺癌的早期筛查和诊断对于改善其预后至关重要。众所周知，不同类型的胰腺癌在病理和预后方面都表现出极大差异，临床上大多数胰腺癌的分型属于胰腺导管腺癌（PDAC），占胰腺外分泌恶性肿瘤的85%以上，因此，我们通常所说的胰腺癌是指PDAC。 鉴于胰腺癌的低发病率和低特异性检测，从普通人群中筛查胰腺癌患者的成效是很低的。美国国家综合癌症网络机构（NCCN）推荐对遗传/家族性高危人群应用超声内镜（EUS）筛查，而应用筛查散发性胰腺癌的策略去筛查具有一种或多种危险因素的个体，常常能提高筛查效果。美国预防服务工作组（USPSTF）表明，胰腺癌的风险因素除了某些遗传性综合征或家族史，还包括新发糖尿病（NODM）、既往糖尿病、高龄、吸烟、肥胖和慢性胰腺炎病史等，Sharma等人就开发了一种包括体重变化、血糖变化和糖尿病发病年龄三个因素在内的疾病预测模型，以确定NODM患者患胰腺癌的风险水平。 当临床怀疑或有证据显示胰腺和/或胆管扩张时，NCCN指南建议应首先使用计算机断层扫描（CT）进行诊断，此外，磁共振成像/胰胆管造影（MRI/MRCP）、EUS、EUS引导的细针穿刺（EUS-FNA）和内窥镜逆行胰胆管造影（ERCP）在诊断胰腺癌中也发挥着重要作用，近年来，影像学和内窥镜技术的创新研究被广泛应用于胰腺肿瘤的诊断上。血清学检查也是胰腺癌重要的辅助诊断方法，糖类抗原19-9（CA19-9）由于其低灵敏性（80%，95%置信区间 [CI]=72%-86%）和低特异性（75%，95%CI=68%-80%），已不能满足临床实际需要。鉴于此，很多研究集中在联合检测CA19-9与其它肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原242（CA242），以及新的血清生物标志物，如巨噬细胞抑制性细胞因子1（MIC-1）和黏蛋白5AC（MUC5AC）。近年来，液体活检也是一种新的诊断方法，该方法通过检测各种可提取体液中的肿瘤相关生物标志物，主要包括环肿瘤 DNA (ctDNA)、循环肿瘤细胞 (CTCs)、外泌体和microRNA(miRNAs)。另外，由代谢组学技术建立的血清代谢物的特征鉴定，也引起了广泛研究。然而，这些方式在成为标准临床诊断工具之前，需要进行更多的临床试验，并结合计算机算法以评估其疗效。 到目前为止，还没有一种或一组具有足够诊断准确性的生物标志物用于胰腺癌的早期诊断。因此，该综述主要探讨目前的筛查和诊断策略，以及未来在危险因素、影像学检查、病理检查、血清学检查、液体活检和其他新的胰腺癌早期诊断方法的应用前景。 2.高危人群及危险因素 2.1具有特定遗传背景的高危人群 胰腺癌由于起病隐匿、恶性程度高、治疗效益低等特点，给患者带来巨大的负担，因此，有必要对普通人群进行胰腺癌的早期筛查。一般不建议对无症状个体进行胰腺癌常规筛查，除非有某些遗传背景，如Peutz-Jeghers综合征或胰腺癌家族史，针对这类人群，可进行非侵入式成像检查或高灵敏度血清学检测。临床上，由于CA19-9的敏感性约为80%，特异性约为75%，其诊断价值受限。 NCCN指南建议可将EUS应用在高危人群的筛查中，在一项前瞻性研究中，通过利用EUS和CT对78例胰腺癌高危个体和149例健康对照进行随访，最终确诊了8例胰腺癌、6例导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMNs)以及3例胰腺外肿瘤。另外，来自美国的一项多中心前瞻性队列研究，对216例无症状胰腺癌高危患者进行随访，最终通过CT、MRI和EUS检测到胰腺异常的比例分别是11%、33.3%和42.6%。 考虑到首次筛查年龄和之后的检查频率，一些研究人员建议首次筛查年龄在40-50岁，如果有家族史，筛查年龄应比家族胰腺癌患者的发病年龄早10-15年。如果首次筛查有异常发现，则建议每3年或每3-6个月进行一次筛查。2018年，国际胰腺癌筛查联盟更新了对家族性胰腺癌风险增加患者的管理建议：针对这类人群，监测应在50岁及以后开始，或者比最年轻的胰腺癌亲属早10年，首选的检测手段应为EUS和MRI/MRCP。值得我们注意的是，改进影像检测技术和探索新的生物标志物仍然是提高早期胰腺癌诊断效率的有利措施。 2.2 散发性胰腺癌的危险因素 在注重筛查家族性高危个体的情况下，许多散发性胰腺癌患者被忽视，因此，有必要对高危人群进行更详细的探讨，以提高胰腺癌患者的检出率和生存结局。男性在胰腺癌中的发病率要高于女性，且这一比例在45岁后逐渐增加，直到80岁达到高峰，鉴于这些客观因素，有必要对散发性病例的危险因素进行全面的探讨。此外，环境因素也会导致胰腺癌的发生，包括生活方式、饮食习惯和相关疾病的发生。 不良生活习惯会促进胰腺癌的发生，例如，吸烟者患胰腺癌的风险大约是不吸烟者的2-3倍，但随着戒烟时间的延长，这种风险会降低。有研究表明，烟草引发胰腺癌的机制之一是通过miR-25-3p和m6A修饰调节致瘤性AKT-p70S6K信号通路的激活，该通路的激活会引起胰管上皮细胞恶性转化。重度饮酒（饮酒≥420g/周）是胰腺癌的另一独立危险因素，且在男性中更为突出（风险比[HR]=1.69,95%CI=1.21-2.37），此外，食用红肉类食品也会增加患病风险（HR=1.16,95%CI=1.01-1.33），因此，保持良好的生活习惯是胰腺癌一级预防的重要措施。 患有慢性胰腺炎、糖尿病、肥胖症等慢性疾病的人群患胰腺癌的风险较高。为了评估不同形式的胰腺炎和胰腺癌之间的关系，Karlson等人实施了一项随访长达25年的队列研究，结果表明，慢性胰腺炎患者4年内罹患胰腺癌的标准化发病率最高，为22.2（95%CI=16.2-29.6），24年内为7.6（95%CI=6.0-9.7）。另外，一项对13个试验进行meta分析的研究表明，慢性胰腺炎患者两年内发展为胰腺癌的综合效应估计值为16.16（95%CI=12.59-20.73），但当过渡期增加到5年时，患癌风险降低。慢性胰腺炎发展胰腺癌的机制尚不清楚，异常激活的信号通路，如转化生长因子-β (TGF-β)、Janus激酶(JAK)/信号传感器和转录激活因子(STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB (NF-κB)、toll样受体(TLRs)等，都可能有助于长期胰腺炎期间胰腺细胞的恶性转化。大量研究表明，糖尿病和高血糖也是胰腺癌的危险因素，来自美国的一项回顾性研究表明，糖尿病人群发生胰腺癌的风险（HR=2.17，95%CI=1.70-2.77）约为普通人群的2倍，而来自中国的一项回顾性临床试验同样表明，糖尿病人群患胰腺癌的风险约（HR=1.87，95%CI=1.48-2.37）为普通人群的2倍，且风险随着糖尿病持续时间的延长而增加，另外，高血糖同样与胰腺癌的发生紧密相关。糖尿病促进胰腺癌发生的机制，部分是由于高水平的胰岛素和胰岛素样生长因子作用于外分泌胰腺细胞，促进其有丝分裂、诱导细胞分化或抑制自噬。作为一个全球性的健康问题，肥胖也是胰腺癌的危险因素，来自英国的一项病例对照研究表明，BMI的增加与胰腺癌风险之间存在显著的因果关系（BMI每增加一个标准差[4.6kg/m2]的odds ratio[OR]=1.34，95%CI=1.09-1.65）。来自中国的一项回顾性研究表明，在胰腺癌患者中，超重（[OR]=2.48，95%CI=1.98-3.11）和肥胖个体（[OR]=3.5，95%CI=2.67-5.41）的比例也更高。研究表明，肥胖通过诱导胰岛胆囊收缩素的异常表达，加速kras驱动的胰腺导管肿瘤的发生，遗传或控制饮食可阻碍胰腺癌的进展。另外，高脂肪饮食通过与肥胖协同作用，也可促进胰腺癌的发展，其机制是通过环氧合酶-2 (COX2)激活致癌性Kras，导致胰腺炎症化和纤维化，进而导致胰腺上皮内瘤变(PanINs)和PDAC的发生。相反，具有Kras突变的腺泡细胞可显著降低成纤维细胞生长因子21的表达，这有助于抑制高脂饮食促进胰腺癌的发展。除此之外，Pang等人研究表明，慢性胆囊炎（OR=1.81，95%CI=1.34-2.44）、胆囊切除术（OR=16，95%CI=8.16-31.5）和低水平的高密度脂蛋白胆固醇C（OR=3.12，95%CI=2.52-3.86）都是胰腺癌发生的危险因素。 2.3 高危人群预测模型 综合胰腺癌的多种危险因素，建立胰腺癌的风险预测模型，有助于胰腺癌的早期发现。NODM患者患胰腺癌的风险是长期糖尿病患者的两倍以上。为了确定NODM患者中患PDAC的高危人群，Boursi等人开发并验证了一种预测模型，包括年龄、BMI、BMI变化、吸烟、使用质子泵抑制剂和抗糖尿病药物，以及血红蛋白A1c (HbA1c)、胆固醇、血红蛋白、肌酐和碱性磷酸酶水平。该模型里，当将预测风险阈值设定为1%时，只有6.19%的NODM人群需要进行进一步筛查，因此，该模型的敏感性极其有限。另外，Chari的团队开发了一个名为“丰富胰腺癌新发糖尿病”(ENDPAC)的模型，该模型对三个因素进行加权评分，包括体重变化、血糖变化和糖尿病发病年龄，通过ENDPAC评分预测过至少有3名确诊的糖尿病患者在发病3年内罹患了胰腺癌，该模型的AUC值为0.87，敏感性和特异性为80%，这种简单有效的模型对胰腺癌的筛查具有潜在价值。 随着核磁共振(NMR)、质谱(MS)等代谢组学技术的发展，血清代谢物在胰腺癌检测中的作用越来越受关注，血浆中的代谢性生物标志物可能有助于胰腺癌的诊断。Michálková等人通过NMR研究了血浆样品中代谢物的变化，并建立了一个由12种代谢物(3-羟基丁酸、乳酸、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、柠檬酸、组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、丙酮和二甲胺)组成的模型，准确率为94%，灵敏度为100%，在区分胰腺癌患者和健康人方面有90%的特异性。此外，Mayerle等人鉴定了生物标志物特征，包括9个代谢物和CA19-9，用于区分PDAC与慢性胰腺炎，其AUC为0.96 (95% CI = 0.93-0.98)，与单独CA19-9相比，诊断效能增高。为了建立针对NODM的胰腺癌筛查策略，我们比较了NODM患者与PDAC和NODM患者的血清样本的代谢组学特征。这项研究鉴定出62种不同的代谢物，发现了包括N -琥珀酰- L-二氨基肟酸和PE(18:2)的一组具有高敏感性(93.3%)和特异性(93.1%)的标志物。目前，血清代谢组学用于筛查NODM人群胰腺癌的研究尚不多见，有待进一步研究。 研究者还通过胰腺癌临床症状和危险因素，建立了高危人群预测模型。北京协和医院(PUMCH)基于10个危险因素(男性、年龄>60岁、饮酒、吸烟、糖尿病史、肉类饮食、胰腺癌家族史、胰腺炎、胆石症史、胆囊炎史)和4种症状(厌食症、上腹痛、体重减轻、黄疸)，建立了胰腺癌高危评分模型，其AUC为0.981。此外，一项来自沙特阿拉伯的回顾性队列研究指出了9个显著增加胰腺癌风险的因素，即老年、男性、体重减轻、腹痛、凝血异常、胰腺炎、黄疸、持续性疲劳和异常影像学表现，该风险评估模型具有良好的预测效用（ROC=96.3%，95% CI = 94.1%-98.6%）和较高的敏感性(94%)，有助于提高筛查效果。因此，全面探讨胰腺癌的危险因素，有效识别高危人群，应用高灵敏度影像学或血清学检查是目前提高胰腺癌早期诊断、治疗和预后的主要策略。 3.检查类型 3.1 影像学 医学影像在胰腺癌的早期筛查、术前评估及分期、鉴别诊断、随访和治疗评价等方面都具有重要作用，然而，到目前为止，还没有一个标准的影像筛查流程。USPSTF指出，CT、MRI和EUS等影像技术已作为筛查胰腺癌高危人群的重要手段，其中，EUS表现最佳。 不同的影像技术对早期胰腺癌的检测有不同的成效，日本的一项多中心回顾性研究明确了200例0期和Ⅰ期PDAC的影像学特征，其中20%的患者已有症状。经腹部超声(TAUS)、CT、MRI和EUS的诊断准确率分别为67.5%、98.0%、86.5%和86.5%，早期胰腺癌在CT、EUS和MRCP中的主要表现是主胰管扩张或不规则狭窄。然而，CT和TAUS对早期PDAC的诊断价值有限，因为这些技术只能看到间接征象，如胰管扩张或胰腺轮廓改变。另外，CT还发现了在0期和I期的实质病变中分别有42%和41.8%存在局部脂肪改变，这意味着检测胰腺的局部脂肪改变对诊断早期胰腺癌有意义。 CT对直径< 2cm的PDAC敏感性较低，而EUS可以检测到较小的实体病变，且无辐射，不需要造影剂，还能顺便取材做病理检测。有研究比较了不同成像技术对直径< 2cm的胰腺癌的敏感性，发现TAUS、CT和EUS的敏感性分别为52.4%、42.8%和95.2%。然而，如果不使用侵袭性细胞学检查(EUS- FNA)，传统的EUS无法很好地区分癌和其他病变，因为即使是良性肿瘤，也表现为低回声，因此，很有必要开发EUS- FNA的无创替代方式。我国一项回顾性研究表明，EUS通过肿瘤大小和边界状况可以显著区分胰腺肿瘤的良恶性，联合其它方式的诊断敏感性为73.68%，特异性为90%。然而，EUS不能提供年龄、性别、位置、回声类型和主胰管扩张等情况。近年来，超声内镜造影(CEHEUS)作为一种微创诊断方法，被证实有助于胰胆道疾病实质灌注和微血管的成像，并有研究表明，CEHEUS与常规EUS相比，具有更高的敏感性（94.5%vs 83.1%）和准确性（84.1% vs 78.6%），另外，一项meta分析表明，CEHEUS对胰腺癌诊断的灵敏性高达93%（95%CI =0.91-0.95），特异性高达80%（95% CI =0.75-0.85）。我们相信，这种方法能完善临床实践中胰腺癌的诊断技术。 需要指出的是，EUS或CEHEUS手术操作相对复杂，其准确性往往受到内镜医师的主观影响。疑似胰腺癌患者常采用EUS检查作为EUS- FNA的一部分，如果EUS-FNA因病变较小而呈阴性，则需要CEHEUS做进一步确诊。此外，MRI也有禁忌症，包括金属植入物和患者幽闭恐惧症，但其在胰腺癌或小型实体胰腺肿瘤的检出率高于CT。尽管如此，CT仍是目前临床上诊断胰腺癌的首选方式。 3.2 病理检查 近年来，EUS-FNA被认为是对疑似胰腺癌患者最先进和准确的诊断技术。在CT发现胰腺病变的患者中，EUS-FNA的敏感性为87.6%，特异性为91.2%，准确性为88.8%。来自中国南方的一项单中心回顾性研究表明，EUS-FNA对胰腺癌的诊断，具有77.8%的敏感性、100%的特异性和84%的准确性。多因素分析显示，腹痛、病变性质、病变转移、病变大小是预测PDAC的独立因素。为了提高EUS-FNA早期诊断的准确性，研究人员对该技术进行了许多改进。实时弹性成像(Real-timeelastography, RTE)是一种利用超声评估组织弹性的新技术，已被用于多种肿瘤的良恶性鉴别。RTE联合EUS-FNA具有较高的诊断准确率、敏感性和特异性，分别为94.4%、93.4%和100%。另外，Bournet等人指出，相比单独应用细胞病理检测，病理评估结合Kras基因突变对PDAC进行诊断，具有更高的准确性（88% vs 73%）和灵敏性（93%vs 85%）。此外，新型光学系统-空间低相干定量显微镜（SL-QPM）能提高EUS-FNA细胞学诊断的准确性，即使在传统细胞病理学无法诊断的时候，SL-QPM也能把细胞学诊断胰腺癌的敏感性从72%提高到94%。在鉴定炎症性肿块和恶性肿瘤方面，超声内镜引导下的细针活检(EUS-FNB)比EUS-FNA具有更高的诊断准确性和敏感性（93.0%和86.6%vs 83.6%和69.5%），因此，在慢性胰腺炎的诊断中，EUS-FNB应被认为是首选方法。此外，一项前瞻性研究比较了慢拉和标准吸引技术对EUS-FNA标本的诊断准确性，二者无明显差异，但慢拉技术减少了载片数量，且减少出血。 ERCP在胆管胰病变的诊断和治疗中具有重要作用。在日本，与EUS-FNA相比，ERCP介导的细胞学检查更常用于术前病理诊断，其在0期胰腺癌患者中的检出率为72.2%，而EUS-FNA的检出率仅为16.7%。然而，导管的位置和大小会影响胰液细胞学检查，而且患者经常会出现ERCP后相关性胰腺炎等并发症。在北京协和医院，使用ERCP进行诊断的患者数量在过去十年中有所下降，而ERCP现在更多地是用于治疗。因此，对于不同分期的胰腺癌，我们应采取适当的诊断方法，并充分考虑患者的病情。 3.3 血清学检测 目前尚无有效的血清肿瘤标志物用于胰腺癌的早期诊断,尽管CA19-9被FDA批准为PDAC的唯一血清生物标志物，但当其诊断Lewis血型阴性表型患者时常出现假阴性，而诊断梗阻性黄疸患者时常出现假阳性，导致其临床应用受限。此外，CA19-9在良性肿瘤、炎性肿块、糖尿病等情况下也会表达增高，这些因素都降低了CA19-9在胰腺癌早期诊断中的应用，它目前常被用作评估治疗效果、监测转移和预测晚期胰腺癌患者生存的重要预后因素。除CA19-9外，其他肿瘤标志物如CEA、CA125、CA242等也被用于胰腺癌的诊断。CA19-9的敏感性最高，约为80%，但在特异性方面没有优势，而CA242的特异性最高，约为90%。而当血清CA19-9、CEA、CA125、CA242同时检测时，敏感性和特异性可高达90.4%和93.8%，明显高于任何单一标志物。因此，疑似胰腺癌的患者需要至少检测这四种肿瘤标志物。此外，复旦大学上海癌症研究中心的研究小组通过Sanger测序将受试者分为三种基因型(Lewis-negative,Mixed, Secretor -negative)，并确定每组的最佳截断值，然后将这些截断值应用于胰腺癌的诊断，结合CA19-9对I、II期胰腺癌的检测灵敏度可由76.1%提高到87.2%。 通过对PDAC患者血清蛋白进行高通量测序筛选，以及对现有癌症基因组数据集进行生物信息学分析，研究者已经发现了许多潜在的胰腺癌诊断新标志物。大量研究报道了通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测新型血清蛋白标记物对胰腺癌的诊断价值，这些蛋白标志物与CA19-9联合应用可有效区分胰腺癌与健康对照、良性肿瘤及慢性胰腺炎（表1）。自身免疫性胰腺炎(AIP) 作为慢性胰腺炎的一种类型，常被误诊为胰腺癌，免疫球蛋白G4 (Immunoglobulin G4，IgG4)是AIP常用的诊断指标，但其区分AIP和胰腺癌的敏感性较低，仅为72%（95% CI =0.68-0.76）。一项通过常规检测来鉴别AIP和PDAC的研究表明，CA19-9、球蛋白、嗜酸性粒细胞和血红蛋白可作为独立鉴定AIP的血清标志物，而这四种标志物组合识别AIP患者的敏感性和特异性分别为92%和79%。此外，研究人员还发现AIP患者的杂交κ/λ抗体水平明显高于胰腺癌患者，血清杂交κ/λ抗体与IgG4联合检测比单独检测IgG4敏感性更高。我们之前还鉴定了几种免疫原性膜抗原(电压依赖性阴离子通道1[VDAC-1]、电压依赖性阴离子通道2[VDAC-2]、螺旋结构域蛋白3[CHCHD3]、气孔蛋白样蛋白2[SLP-2]、线粒体外膜转位酶[TOM])，胰腺癌患者外周血中这些特异性抗体的水平很高。因此，血浆中特异性自身抗体的检测也可能有助于胰腺癌的早期诊断，这需要进一步的临床研究加以验证。 近年来，糖蛋白组学成为了蛋白质组学的一个分支领域，蛋白质糖基化的肿瘤特异性变异也可能有助于胰腺癌的早期诊断。Aronsson等人通过绘制1000种蛋白的糖基化谱，确定了10个候选糖蛋白生物标志物，并随后在胰腺癌患者的血清样本中验证了这些标志物。CA19-9、IL.17E、B7.1和DR6这一组标志物，能比CA19-9更有效地区分I期胰腺癌和健康对照，其AUC值为0.988，灵敏性高达100%，特异性高达90%。除了合成聚糖分析，结构特异性聚糖分析也被认为有可能提供具有高特异性的生物标志物。Liu等通过对异构聚糖的分离、鉴定和相对定量，发现了25个在胰腺癌中发生显著改变的特异性异构生物标志物，这类标志物区分胰腺癌患者和健康对照的诊断AUC值为0.976，其敏感性为93.5%，特异性为90.6%。这些结果表明，蛋白质组学技术将更有利于发现更多潜在的肿瘤特异性生物标志物，随着不同类型的肿瘤特异性血清生物标志物数量的快速增加，预计未来将结合不同的数据，产生一种成熟而简单的算术模型，这将确保有效的诊断标记物尽快地应用于临床。 表1 新血清标志物结合CA19-9在胰腺癌中的诊断价值
* CA19-9在检测胰腺癌中独立的敏感性和特异性。 缩写：RPC：可切除胰腺癌；NPC：非胰腺癌；EPC：早期胰腺癌；HC：健康对照；BC：良性对照；BPT：良性胰腺肿瘤；CP：慢性胰腺炎；IL-6：白介素6；MUC5AC：黏蛋白5AC；MIC：巨噬细胞抑制细胞因子；ADH：抗利尿激素；Gal-1：半乳糖凝集素1；APOE：载脂蛋白E；ITIH3：胰蛋白酶抑制重链分子H3；APOA1：载脂蛋白A1；APOL1：载脂蛋白L1；DKK-1:分泌性糖蛋白1；GDF-15：生长分化因子15；IGF-1：胰岛素生长因子1；LGR-1：富亮氨酸α2糖蛋白1；ApoAII-ATQ/AT：载脂蛋白A2亚型；TFF：三叶因子；TFPI:组织因子途径抑制剂；TNC-FN III-C：腱生蛋白；ND：无描述；NA：不适用。 4.液体活检 在过去的几十年里，使用液体活检来分析血液、尿液和唾液等液体中循环的肿瘤生物标志物受到了极大的关注。与传统的组织活检不同，液体活检可通过非侵入性和实时的方式评估全面的癌症状况（图1）。在液体活检的临床应用中，设备的开发已经取得了巨大的进展。众多证据表明CTCs、ctDNA、miRNAs和外泌体的液体活检已被癌症研究人员广泛利用。
图1 液体活检用于胰腺癌的早期筛查和诊断 与传统组织活检相比，液体活检有很多优势（蓝框所示），包括循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA (ctDNA)、microRNAs (miRNAs)和外泌体在内的液体活检具有非侵入性和实时评估的优势。除了血液，其他液体，包括唾液、胰液、尿液和粪便，在胰腺癌的早期筛查和诊断中也发挥着重要作用(橙框所示) 4.1 CTCs和ctDNA CTCs被定义为来自外周血中实体肿瘤的癌细胞，通过肿瘤诱导生成的血管进入血液循环，因此，CTCs通常代表了原发肿瘤侵袭和转移的能力。CTC对于检测胰腺癌具有重要诊断价值，那些有CTCs的患者总生存率低于无CTCs的患者（HR=1.558，95%CI=1.238-1.961）。然而，由于CTCs在不同胰腺癌分期的诊断灵敏性波动很大（从25%到100%），因此，它的诊断价值被很多研究者质疑。利用微流控纳米NanoVelcro CTC芯片，Ankeny等人评估了来自PDAC患者样本的CTCs，结果表明CTCs的存在可被认为PDAC的诊断标准，其敏感性为75%，特异性为96.4%（AUC=0.867，95%CI=0.798-0.935，P<0.001）,此外，当截断值在4ml静脉血中大于等于3个CTCs时，CTCs还是鉴别局部/区域性和转移性疾病的有效生物标志物（AUC=0.885，95%CI=0.80-0.969，P<0.001）。除了根据上皮细胞标志物上皮细胞粘附分子（EpCAM）的表达捕获CTCs外，新的研究还探索了其他细胞表面标记物，如叶酸受体和间质细胞标志物波形蛋白，这些标志物在区分PDAC和良性肿瘤及健康患者之间表现出良好的诊断效价。将叶酸受体阳性和波形蛋白阳性的CTCs和CA19-9结合，能进一步提高诊断效价，其AUC值分别是0.944和0.968，结合CTCs和其他生物标志物的液体活检有望提供一种可靠的、具有足够敏感性的无创诊断方法。值得注意的是，结合CTCs和蛋白多糖-1 (GPC-1)阳性外泌体的检测，诊断可切除胰腺癌的敏感性可高达100%。然而，CTCs检测受制于分析前和分析步骤的技术变化，CTCs的检测首先通过密度梯度离心或免疫捕获技术进行富集，然后通过抗上皮特异蛋白的抗体或基于PCR的肿瘤特异mRNA或上皮特异mRNA进行免疫化学检测。由于血液中CTCs稀少，有必要开发和生产新的技术和设备来提高CTCs对癌症的诊断准确性，因此，必须阐明改进的技术和方法，以证明这些方法具有常规适用性。 游离DNA（cfDNA）是指在血液中非细胞成分中发现的DNA片段，它们的长度大约是150-200个碱基对，半衰期为一个小时或更短。凋亡或坏死肿瘤细胞释放的cfDNA被称为ctDNA，这是目前肿瘤液体活检工作的主要方向。癌症驱动基因的检测有利于癌症的诊断，如循环中的Kras突变常被用于胰腺癌的检测，因此在血浆中发现的每一个突变都可以在原发肿瘤中被识别出来。Cohen等人发现Kras突变主要位于密码子12，仅30%的患者能检测到这一突变，在II期患者中比I期患者更常见，然而，将KRAS突变和四种蛋白标记物(CA19-9,CEA，肝细胞生长因子和骨桥蛋白)结合，可将敏感性提高到64%，特异性提到99.5%。此外，通过单链文库制备和基于杂交捕获的cfDNA测序方法，可以修复短链或受损的cfDNA片段，Liu等人发现对Kras突变的检测可作为区分PDAC和健康人的有效方式（AUC=0.863，95%CI=0.830-0.898）,这与基于PCR或下一代测序(NGS)方法相比，检出率更高。另外，Kras、TP53、CDKN2A和SMAD4这四种基因结合检测有利于提高诊断PDAC的准确性（AUC=0.921，95%CI=0.890-0.956），其灵敏性高达80%，特异性高达100%。此外，研究发现，小突变片段在癌前IPMN和早期患者(I/II期)中普遍存在，此阶段，KRASG12D的显性峰长为75-85 bp，而在晚期患者中为150 bp，这有助于提出一种基于碎片大小的早期胰腺癌检测方法。在不同的癌症患者中，ctDNA在总cfDNA中的水平波动很大，从低于0.1%到大于 90%，此外，ctDNA在晚期胰腺癌患者中的检出率为75%，在局限性胰腺癌中检出率较低，只有48%，但是，很难确定ctDNA的来源和预测潜在的癌症类型。 值得注意的是，表观遗传重编程，如DNA甲基化发生在肿瘤发生的最早阶段。这在不同的组织中显示出不同的模式，在癌症的发展和进展中起着重要的作用。因此，检测ctDNA的DNA甲基化被认为是肿瘤早期筛查的一个突破点。通过利用一种新开发的技术——珠子上的甲基化(MOB)，Eissa等人发现，ADAMTS1和BNC1，以及两者的结合对胰腺癌诊断的敏感性分别为87.2%、64.1%和97.4%，而针对I/II期胰腺癌的诊断，双基因结合检测显示出高达94.8%的敏感性和91.6%的特异性。尽管这两个基因和CA19-9的结合没有导致诊断敏感性增加，但它表现出比单独CA19-9更高的AUC值（AUC=0.95，95%CI=0.9-0.98）。另外，核小体也可释放到血循环中，因此，血清或血浆中完整的核小体水平也可能作为胰腺癌的潜在诊断生物标志物。Bauden等人通过一种新式ELISA检测法，鉴定出5种循环核小体生物标志物，包括5MC，H2AZ，H2A1.1,H3K4me2和H2AK119Ub。这组标志物能有效诊断胰腺癌，其AUC值高达0.95，显著高于单独应用CA19-9。另外，将CA19-9和5MC，H2AZ，H2A1.1,H3K4me2这四种标志物结合，可表现出最高的AUC值（0.98），以及92%的诊断灵敏度和90%的诊断特异性。 4.2 循环miRNAs miRNAs是一种小的非编码RNA分子，长度约为18-22个核苷酸，能调控基因的转录后表达，在肿瘤发生和转移中发挥重要作用。胰腺癌与正常组织或胰腺癌不同分期之间的miRNAs表达差异是胰腺癌诊断的先决条件。据报道，miR-103、miR-107过表达和miR-155低表达可用于区分胰腺癌和正常对照，与非肿瘤性导管上皮相比，miR-155在PanIN-2(2.6倍)和PanIN-3(7.4倍)中均显著过表达，而miR-196b仅在PanIN-3组织中表达。然而，如上所述，组织活检是一种有创方法，其对较小病变的阳性检出率较低，限制了常规检查的应用。 近年来，越来越多的研究报道了血液miRNAs作为胰腺癌诊断生物标志物的潜在价值。miRNA在血液中非常稳定，可以通过各种方法检测，如逆转录定量PCR (RT-qPCR)、原位杂交、下一代测序和miRNA芯片。通过使用Illumina SBS技术和基于水解探针的RT-qPCR分析，来自中国的一项病例对照研究表明，与对照组相比，胰腺癌患者中显著表达7个miRNAs(miR-20a, miR-21，miR-24, miR25, miR99a,miR185和miR191)，而基于这7个miRNA的生物标志物模式对胰腺癌的诊断准确率为83.6%，高于CA19-9的56.4%。另外一项来自中国的研究，鉴定了6个在胰腺癌患者血清中显著上调的miRNA，分别是let-7b-5a、miR-192-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-223-3p和miR-25-3p。这6个miRNA组合能表现出高达93.3%的诊断灵敏性和96%的诊断特异性（AUC=0.978,95%CI=0.966-0.998）。发表在JAMA上的一项研究报告表明，通过检测全血miRNAs谱，与对照组相比，胰腺癌患者中有38个miRNAs明显表达失调，研究人员因此创建了两种诊断模式，模式一包含miR-145、miR-150、miR-223和miR-636，其AUC值为0.86（95%CI=0.82-0.9），具有85%的灵敏性和64%的特异性，模式二包含miR-26b、miR-34a、miR-122、miR-126、miR-145、miR-150、miR-223、miR-505、miR-636和miR-885.5p，其AUC值为0.93（95%CI=0.90-0.96），具有85%的灵敏性和85%的特异性。另外，与单独应用CA19-9相比（AUC=0.90,95%CI=0.87-0.94），当模式一和CA19-9结合诊断时，AUC值可高达0.94（95%CI=0.90-0.98，P = 0.1）。 近来，越来越多的研究报道了具备胰腺癌诊断价值的miRNA，包括miR-16，miR-196a，miR-1290，miR-1246，miR-223，miR-5100，miR-8073，miR-642b-3p，miR-663a，miR-21-5p，miR-133a等，而这些miRNA与CA19-9结合，通常能表现出更好的诊断效果（表2）。另外，与单一标志物相比，把不同类型的生物标志物结合（如miR-21/ miR-25、CA19-9和MIC-1）能有效提高对胰腺癌的诊断效能。基于这些研究，miRNAs可能成为最广泛和最有前途的非侵袭性生物标志物之一，但在未来的临床应用中，还需要更多更大队列的研究来验证miRNAs的诊断效能。 表2 miRNA诊断胰腺癌的诊断效能
*CA19-9单独用于胰腺癌诊断的AUC值、灵敏度和特异度。 简写：PC：胰腺癌；HC：健康对照；ND：无描述；NA：不适用 4.3 循环外泌体 外泌体是由脂质双分子层包裹的细胞外载体(EV)，大小约为30-150nm，由各种膜蛋白穿插脂质双分子层组成，其中包含各种核酸、蛋白质和脂质。外泌体由包括肿瘤细胞在内的所有细胞分泌，并在血液中循环。最近，越来越多的研究强调EV或循环外泌体(crExos)在胰腺癌早期检测中具有潜在诊断价值。通过使用多个等离子体分析循环肿瘤来源的EV，Yang等人鉴定了一种基于EV的蛋白标记谱，包括EGFR、EpCAM、MUC-1、GPC-1和WNT2，其检测PDAC的准确率为84%，敏感性为86%，特异性为81%。在这些标志物中，GPC-1表现最佳，表明它有诊断胰腺癌的潜在价值。在另一项研究中，Melo等人使用质谱分析确定了GPC-1在癌细胞来源的外泌体上的特异性富集水平。他们发现，所有胰腺癌患者的crExos表达的GPC-1水平明显高于健康对照组，敏感度为100%，特异性为100%。此外，在GPC-1+crExos中检测到突变的Kras转录本，支持了它们的癌细胞来源。为了克服外泌体及其蛋白质捕获和分析困难的问题，Lewis等人采用交流电动微阵列芯片来捕获和分析crExos，以此替代抗体捕获的方法。他们报道了GPC-1和CD63具有有效的诊断效能，其敏感性为99%，特异性为82%。此外，结合CTC和GPC-1+外泌体检测，敏感性可达100%，特异性为80%，说明结合不同生物标志物的液体活检具有潜在的诊断价值。 尽管有许多研究报道了crExos在胰腺癌中的诊断价值，但由于缺乏特异性标记物或识别方法，从癌源性外泌体中分离并将其从非癌源性外泌体中鉴别仍存在困难。Melo等人发现在PDAC中的crExos，其平均尺寸要显著小于其它crExos，且Kras突变转录仅能在GPC+的crExos中检测到。因此，结合外泌体的大小和GPC-1的检测来识别癌症来源的外泌体并随后继续检测其他生物标志物是有潜在临床应用价值的。 4.4 其他液体活检方法 胰液含有从胰管细胞脱落的DNA和RNA,通过对胰腺癌患者的胰液进行遗传分析，可以检测到突变DNA，如Kras、TP53和SMAD4，从而区分胰腺癌与健康对照或癌前病变, 此外，在胰液中还发现了腺瘤样息肉(APC)启动子和组胺受体H2 (HRH2)基因甲基化，这可作为潜在的诊断生物标志物。通过检测来自胰液外泌体来源的miRNAs，日本研究人员发现miR-21和miR-155水平可以区分PDAC患者和慢性胰腺炎患者，AUC分别为0.90和0.89，与细胞学结合还能显示出更高的准确性。另外，Kras突变还存在于88%的胰腺癌患者和19.6%的正常人的粪便中，在粪便中检测miR-181b和miR-210可以区分胰腺癌患者与正常人，但是，外周血对胰腺癌的检测无疑比胰液和粪便标本更方便。 唾液是人体口腔中重要的生物液体，采集方便，无任何侵入性操作。研究人员已经鉴定了许多唾液mRNA生物标志物，如Kras、ACRV1和MBD3L2，可用于区分胰腺癌患者和健康对照组，并通过结合这些生物标志物在鉴别胰腺炎患者方面取得了更高的准确性，也有研究关注于唾液代谢物和微生物群在胰腺癌患者中的诊断价值以及潜在的生物标志物。另外，Radon等人通过使用质谱进行深入的蛋白质组学分析，在尿样(LYVE-1、REG1A和TFF1)中确定了一组可用于胰腺癌诊断的三种蛋白质，用此组合诊断Ⅰ-Ⅱ期的PDAC，AUC为0.90（95%CI=0.84-0.96），当结合血清CA19-9时，其AUC值可高达0.97（95%CI=0.94-0.99）。有研究表明，与正常人相比，尿液miRNA(miR-143、miR-223、miR-30e)在Ⅰ期PDAC患者中表达显著升高，这将为早期胰腺癌和慢性胰腺炎的诊断提供潜在价值。 有许多研究集中在液体活检，旨在提高胰腺癌的早期诊断。然而，当涉及到它们的实际临床应用时，挑战出现了。正如蒙彼利埃大学医学中心(University Medical Centre of Montpellier)的癌症细胞生物学家Catherine Alix-Panabières (Catherine Alix-Panabières)所说，仍需要进行更多的介入性临床试验，以及开发一种算法来整合多种合适的液体生物标记物，而决策者和厂商也必须参与其中。 5. 其它潜在诊断策略 CT、MRI和EUS等基于图像的检查是目前胰腺癌诊断中广泛使用的方法，而这类检测的准确性与操作人员的经验是紧密相关的。人工智能技术和计算机辅助诊断系统正在兴起，应该会带来潜在的诊断价值。例如，Ozkan等人利用胰腺癌患者和非癌症患者的EUS图像开发了一种高性能的计算机辅助诊断系统，该系统具有图像处理和模式识别功能。他们确定了在3个年龄组(<40岁、40 -60岁和>60岁)中表现出不同的20个最合适的特征，诊断敏感性分别为87.5%、85.7%和93.3%。 肿瘤可以分泌特定的挥发性有机化合物(VOCs)，这些化合物可以从尿液、呼吸和粪便的气味中检测到，犬科动物也可以感觉到这类物质。在此基础上，研究人员试图利用训练有素的狗的嗅觉系统来检测前列腺癌，但很少有关于类似胰腺癌的研究。场非对称波形离子迁移谱(IMS)是一种灵敏的VOCs检测技术，Nissinen等人证明，场不对称波形IMS可区分胰腺癌或癌前胰腺病变患者与健康个体的尿液样本，其敏感性为85%，特异性为75%，但准确性不足。此外，Covington的团队还利用IMS检测了参与者的尿液VOCs，并开发了一种算法，将PDAC样本与健康对照组区分开来，其AUC为0.92，敏感性为91%，特异性为83%。最近，同一组报告称，气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)和气相-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)都能够高度可信地将PDAC与健康对照组区分开来，其AUC超过0.85。化学鉴定进一步表明2,6-二甲基辛烷、壬烷、4-乙基-1,2-二甲基苯和2-戊酮在这些基团的鉴别中起重要作用。此外，研究人员还分析了胰腺癌患者潮气呼吸时肺泡空气中的VOCs，Princivalle等利用离子-分子反应MS技术，在肺泡空气中鉴别出10个能够显著区分胰腺癌与对照的VOCs，其AUC为0.99，敏感性为100%，特异性为84%。因此，通过尿液样本或肺泡空气中的VOCs检测胰腺癌是一种很有前景的策略，具有无创操作和易于采集的优点。 近年来，对新型纳米材料的研究越来越多，荧光纳米粒子等纳米材料的生物相容性允许它们用于标记和检测生物分子，从而作为潜在的癌症早期诊断工具。例如，研究人员发现了超pH敏感荧光纳米探针，它在循环中是沉默的，但可以在肿瘤细胞外pH值低时被激活，在包括胰腺癌在内的肿瘤模型中显示出广泛的肿瘤成像特异性和有效性。这些结果表明，医学与计算机科学、化学等其他学科的结合，有利于提高早期胰腺癌的检测水平。 结论 胰腺癌作为预后差的高恶性肿瘤，一直受到世界各国科学家的关注，为提高其诊断准确率和早期检出率进行了大量的研究。加强科学教育，扩大早期筛查人群是显著改善胰腺癌患者预后的关键。更重要的是，正如各种指南所建议的，在胰腺癌诊断和治疗的整个过程中，包括诊断部门(检验科、放射科、超声科)和治疗部门(外科、胃肠科、肿瘤科)的多学科合作是必不可少的。因此，必须深化跨学科融合，加强不同学科之间的合作，以加快科研成果的产生和临床转化。
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