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1904年5月4日正式掌控运河工程资产，继承了法国人留下的残余劳动力和一堆近乎废弃的工地建筑、基础设施和工程设备。美国政府成立了地峡运河委员会（the Isthmian Canal Commission，ICC），以控制巴拿马运河区和监督工程进展。委员会直接向战争部长威廉·霍华德·塔夫特报告，以免一直困扰法国公司的低效率和腐败问题重现。
1904年5月6日，西奥多·罗斯福总统任命伊利诺伊中央铁路前总工程师和总经理约翰·芬德利·华莱士为巴拿马运河项目总工程师。由于饱受巴拿马的传染病困扰，加上被迫使用法国人的残旧基建和设备，以及受到极度官僚的地峡运河委员会掣肘，华莱士于1905年6月突然辞职，由自学成才并曾建造大北方铁路的约翰·弗兰克·史蒂文斯接任。史蒂文斯不是地峡运河委员会的成员，并越发认为这个官僚机构阻碍工作，于是绕过委员会直接向华府的总统行政团队报告。
史蒂文斯在巴拿马运河工程上的成就之一是建设了数千名工人急需的住房、供水系统、修理店、仓库和其他基础设施。他从美国和其他地区招募了数千名工人到运河区工作，尽力提供能让工人安全舒适地工作和生活的食宿条件，又重修和扩建巴拿马铁路，方便了日后把从凿山工程挖出、数以百万吨计的土方运送到建造查格雷斯河大坝的工地。
当时，古巴医生胡安·卡洛斯·芬莱已经发现导致2万多名法国工人丧生的黄热病是由蚊子传播。因此，1904年被任命为巴拿马运河工程首席卫生官员的陆军上校威廉·克劳福德·戈加斯医生致力执行一系列“巴拿马运河开凿期间新卫生措施”，包括改善城市供水系统、采用烟熏法消毒建筑物、向蚊虫滋生区域喷洒油和杀虫剂、安装窗纱和净化污水等。尽管遭到了地峡运河委员会部分成员的反对，戈加斯坚持这些措施，史蒂文斯上任后亦全力支持这一项目。经过了两年的艰苦努力，戈加斯在1905年大致上消灭了黄热病。尽管如此，仍有大约5600名工人在美国修建运河期间因疾病和意外事故死亡。
1905年，在运河设计仍未定案时，一个美国工程小组受托前往检视其情况，小组之后向罗斯福总统建议采用法国人曾经尝试过的、和海平面高度一致的设计方案。1906年，华盛顿传召史蒂文斯回国并命令他采用这一方案，曾亲历查格雷斯河洪水的史蒂文斯极力反对，他提出附建船闸的方案，建造当时世界上最大的水坝（嘎顿水坝）和面积最大、水位在海拔85英尺（26米）的人工湖（嘎顿湖），并透过控制巨型闸门调节填满船闸的湖水，以升高和降低船只，嘎顿湖将通过库雷布拉山开凿工程与太平洋相连。史蒂文斯最终成功说服总统采用这一方案。
附有船闸的方案需要挖掘近1.3亿立方米的土方。美国迅速替换及更新了法国遗留的陈旧工程设备，包括从马里昂电铲公司购买了约102台新型轨道式蒸汽挖掘机，以及运来巨大的蒸汽起重机、液压碎石机、水泥搅拌机、挖泥船和气动钻头，几乎所有这些设备都是在美国透过新的机械制造技术产生的。铁路亦需要彻底升级为双轨载重系统，以承载新的货运车辆。由于新生的嘎顿湖淹没不少旧铁路沿线地区，因此需要在高于湖面水位的地方兴建新的线路。
1838年英属西印度群岛的解放行动使超过50万奴隶获得了自由，彻底改变了这些岛屿的经济和社会结构。多数获得自由的人不想继续在种植园工作，导致蔗糖工业逐渐衰退。殖民地的白人上流阶层和混血中产阶层成功重建了社会等级制度，导致黑人仍然处于底层。获解放的黑人由于生活艰难，只得从事包括国外的任何工作，由此开启了跨越加勒比海的人口流散。
1849年的加利福尼亚淘金热重新唤起了发展现代交通横越中美洲的兴趣，并鼓励大量获解放的黑人迁移他处。两条迁移路线逐渐发展起来，一条由范德比公司经营，以蒸汽船横越尼加拉瓜湖并以马车来往驿站；另一条则是由纽约公司经营的巴拿马铁路。两所企业聘用大量以牙买加人为主的外国劳动力，当中约5,000人最后在巴拿马铁路工作。两项计划证明了西印度群岛的黑人比其他工人更能抵抗热带传染病；而群岛地区的经济衰退也释放了更多黑人并提供了大量劳动力。
19世纪80年代，法国的运河工程和香蕉种植业的扩张，再度掀起加勒比海地区的人口迁徙。法国公司在巴拿马运河工程中雇佣了超过50,000名西印度群岛居民（多数仍为牙买加人）。香蕉种植同样刺激了当地19世纪80年代后的经济增长，扩张了商业种植园的规模并鼓励了数以千计的人口迁徙。到20世纪初期，联合果品公司运营着包括哥斯达黎加的利蒙港，以及巴拿马的博卡斯德尔托罗等多个香蕉港口。
1904-1914年间，由于美国人建设巴拿马运河，出现了由西印度群岛向巴拿马的潮汐型人口迁移，至今仍是加勒比海地区史上最大规模的迁徙。根据官方数据，运河管理局带来了超过31,000名西印度群岛男人和一些女人，但现代的估计显示实际上有多达150,000到200,000名男女在这段时期迁移过来。大部分黑人原本没计划留在巴拿马，但由于西印度群岛几乎无法提供足以媲美前者的工资和福利的工作，使得数万人最终定居巴拿马并结婚生子，成为了人口稀疏的巴拿马境内最大的移民群体，他们的后代今日被称为非裔巴拿马人。
1907年，史蒂文斯辞去总工程师一职，罗斯福总统任命美国陆军工程兵团少校乔治·华盛顿·戈索尔斯接替他。戈索尔斯有别于前任，是一名强壮的西点军校毕业军官和土木工程师，并具建设运河的经验。戈索尔斯最终在1914年完成巴拿马运河工程，比预定日期（1916年6月10日）提早了两年。戈索尔斯将工程和挖掘工作划分为三段：大西洋段、中央段和太平洋段。 大西洋段由陆军少校威廉·L·希尔伯特指挥，负责建造利蒙湾处的巨大防波堤、嘎顿船闸、5.6千米长的进港航道和巨大的嘎顿水坝；太平洋段由西尼·B·威廉姆森（工程高层中的唯一平民）指挥，负责建设巴拿马湾沿岸长4.8千米的防波堤，进港航道和船闸及其附属水坝和水库；中央段由陆军工程兵部队少校大卫·杜翰西·盖拉德指挥，负责最艰巨的工作之一：开凿库雷布拉山以连接嘎顿湖和太平洋的巴拿马湾船闸。
1913年10月10日，威尔逊总统在白宫通过电报信号引爆了摧毁甘博亚大堤的炸药，大水漫过库雷布拉山开凿的河道，将大西洋和太平洋连接在了一起。亚历山大峡谷号（一艘于1887年下水的浮式起重机）是第一艘通过运河跨越两大洋的自驱动船只，它从大西洋一侧正在施工的河道进入运河，最终在1914年1月7日到达太平洋。SS克里斯托瓦尔号（一艘由马里兰钢铁厂建造的客货两用船，于1902年以SS特里蒙特号的名字下水）于1914年8月3日成为第一艘完整通过运河的轮船。
在瓦斯科·努涅斯·德·巴尔沃亚首次穿越巴拿马地峡的401年之后，巴拿马运河的建设工程于1914年完成。美国在建设工程上花费了大约5亿美元（折合现在约91.7亿美元），是迄今为止美洲最大的工程项目。运河于1914年8月15日正式开通，之后首艘通过的船只是货船SS安孔号。由于巴拿马运河的开通改变了海上贸易路线，导致了智利港口吞吐量的显著下降。 到了20世纪30年代前期，人们发现运河面临着供水问题，于是开始建造马登水坝，以拦截嘎顿湖上游的查格雷斯河。马登水坝于1935年完工，同时造就了马登湖（之后被称为阿拉胡埃拉湖），为运河提供了更大的储水空间。1939年，美国着手建造新的船闸，以承载当时正在建造和计划建造的更大型军舰。这项工程持续了几年时间，同时还开始挖掘新的进港航道，但整项计划在第二次世界大战结束后被取消。在第二次世界大战期间，美国利用运河将航空母舰送去补充几乎全毁的太平洋舰队。航空母舰虽然能够通过运河，但有时需要先拆除航标，腾出航道。 |
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