原文出处：Masetti M, Carriero R, Portale F, et al. Lipid-loaded tumor-associated macrophages sustain tumor growth and invasiveness in prostate cancer. J Exp Med. 2022;219(2):e20210564.癌症相关炎症在大多数癌症类型的进展中起着至关重要的作用。固有免疫系统和适应性免疫系统在肿瘤发病时与肿瘤相互作用，从而在原位建立免疫反应。大量证据表明，癌症细胞可以通过重新编程免疫系统来协调这种致瘤反应。相应地，免疫检查点抑制剂和恢复适应性抗肿瘤免疫在越来越多的肿瘤类型中显示出强大的治疗作用。许多癌症（如肝细胞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌）的免疫状态已被详细研究，并揭示了其免疫浸润的复杂性和异质性。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAM）是前列腺癌免疫浸润的重要组成部分，其可促进癌症细胞增殖和侵袭，增强血管生成，并促进免疫耐受。TAM也会在某些情况下加速肿瘤对标准疗法以及免疫疗法的抵抗。据报道，TAM可诱导肿瘤化疗耐药性，TAM的消耗可提高多西紫杉醇治疗去势耐药性前列腺癌症的疗效。因此针对耗尽TAM或使其向抗肿瘤原性状态复极的临床药物的开发仍然是亟需解决的问题，但由于癌症细胞和浸润性巨噬细胞之间相互作用的复杂性使得这个进程受到阻碍。癌症细胞的脂质代谢失调在肿瘤生长中起着重要作用。同样，巨噬细胞的代谢特征可以与癌症相关的方式改变其功能状态。因此为了更好地定义PCa的肿瘤微环境中的组成成分和功能作用，作者进行了scRNA-seq分析人类晚期PCa的免疫浸润情况。这些分析和功能研究确定了一组高度富集的载脂巨噬细胞，这些巨噬细胞与癌症进展和无病生存率降低（DFS）呈正相关，并在PCa小鼠模型中驱动化疗耐药性。从机制上讲，肿瘤微环境中相互作用细胞因子信号影响TAM脂质代谢和癌症细胞迁移，并为晚期PCa提供新的治疗靶点。
为了研究TAMs的转录谱，作者选取三名Gleason评分等于9的未经治疗的PCa患者新鲜肿瘤切除组织，从每个患者的肿瘤组织和相邻的非肿瘤组织中分离CD45 免疫细胞后进行scRNA-seq。（图1A）。随后对10951个肿瘤内和6362个肿瘤外质控阳性细胞进行了分析，并为每个簇生成了一最可变和差异表达的基因列表。根据可用数据集对谱系特异性和簇富集基因的交叉检查，整合产生了细胞特异性转录组特征，共识别了18个簇，包括多种免疫亚群，其中以淋巴起源的细胞占优势（图1，B和C）。与匹配的相邻组织相比，肿瘤中的免疫浸润发生了显著重编程。肿瘤中检测到癌相关自然杀伤细胞（NK）显著减少，肿瘤浸润性调节性T细胞（Treg）细胞和树突状细胞（DC）增加（图1，D–G）。作者同时还鉴定了两种单核细胞/巨噬细胞亚群，Cl2（Mac1）和Cl11（Mac2），与正常组织相比，Mac2在肿瘤组织中显著富集（图1G）。上述结果表明，高侵袭性前列腺癌组织中发生免疫重编，且在肿瘤组织中，巨噬细胞亚群显著富集。图1. 
2. TAM显示脂质代谢相关通路的失调 为了进一步分析上述结果样本中TAM的分子特征，作者探索了在正常和肿瘤条件下与Mac1和Mac2簇相关的生物学途径。IPA作图分析显示，在脂质代谢和脂质摄入相关的过程，包括PPAR信号通路、动脉粥样硬化信号通路、VDR/RXR和LXR/RXR活化途径中，Mac2的富集更显著。且与正常对照物（nMc2）相比，肿瘤内Mac2（itMac2）在部分过程中进一步富集，表明肿瘤微环境对浸润巨噬细胞的转录组产生影响（图2A）。随后，作者对Mac1和Mac2巨噬细胞簇进行了比较研究，确定了部分差异表达基因（图2，B和C）。与Mac1簇相比，对Mac2中差异表达的基因进行通路富集，结果显示Mac2富集在与脂质代谢和脂质摄入调节相关的过程（图2D）。为了更深入地探讨巨噬细胞亚群之间的可能异质性，作者根据差异表达的基因对巨噬细胞簇进行了隔离。在这些亚簇中，与正常组织相比，Cl3-MARCO_Mac是肿瘤中唯一显著富集的亚组（图S1D）。为了在肿瘤背景下进一步研究MARCO_Mac，作者首先确定肿瘤巨噬细胞亚群中发生的基因表达变化。根据属于不同簇的细胞的基因表达变化推断出假时间轨迹，将MARCO_Mac识别为具有不同轨迹路径和高伪时间值的集群，表明该子集具有不同的功能分布，由于MARCO_Mac显示出更高的伪时间值，因此表明Mac2可能比Mac1更成熟。（图2，E和F）。综上所述，作者通过对人PCa的scRNA-seq数据分析，识别出了特异性富集的肿瘤浸润巨噬细胞子集，并定义为MARCO_Mac，其特征是脂质相关通路中的转录扰动。图2. 
3.MARCO_Mac确定了一个在人类PCa中具有预后意义的巨噬细胞亚群 MARCO是巨噬细胞表面的一种清道夫受体。此前已有研究表明，在实体瘤小鼠模型中，使用MARCO抗体可以逆转TAM的免疫抑制作用，并减少肿瘤的进展。但其中的作用机制和特异性抗体对巨噬细胞极化的影响程度尚不清楚。因此作者为了验证表达MARCO的TAMs可通过激活脂质相关途径促进了PCa中TAMs脂质积累进行了验证。首先作者对PCa患者肿瘤切片进行了免疫荧光染色，结果显示CD68 细胞的细胞质中脂质的大量积聚（图2，I和J）。先前的结果显示，MARCO是TAM的独特标记（图3A）。且由于MARCO与修饰脂蛋白的摄取有关，作者假设这种清道夫受体可能与PCa中TAMs的脂质含量增加有关。为了验证这一点，作者再次进行了免疫荧光染色。结果显示，MARCO表达于CD68 TAM中（图3B），且BODIPY与MARCO染色呈现共定位（图3C），提示MARCO与PCa中TAM中脂质积累之间的联系。同时，人类TCGA PCa数据集显示MARCO的表达与泛巨噬细胞标志物CD68之间存在显著的正相关（图3D）。MARCO表达与PCa中的肿瘤进展相关，与低级别肿瘤（Gleason=6）相比，高级别肿瘤患者（Gleason=9–10）中MARCO的表达明显更高（图3E）。MARCO表达与PCa患者中PTEN丢失显著相关，PTEN是人类PCa中的驱动突变，提示预后不良（图3F）。在这些结果的基础上，作者基于可以调节MARCO_Mac功能状态的差异表达基因推导出了簇特异性基因签名（图3G）。该特征清晰地区分了MARCO_Mac簇在免疫细胞的浸润中的作用（图3H）。同时，MARCO_Mac基因表达签名与Gleason评分和DFS相关（图3 I-J）。总综上所述，MARCO是潜在参与PCa进展的TAM相关标记物，MARCO_Mac定义了一个在人类PCa中具有预后意义的巨噬细胞亚群。图3. 
4. 在PCa小鼠模型中，载脂TAM的丰度与肿瘤侵袭性呈正相关 为了进一步研究TAM和前列腺癌症细胞之间的相互作用，作者构建了肿瘤低与高侵袭性的两种PCa基因工程小鼠模型。Ptenpc−/−模型发展为进展缓慢的人类前列腺上皮内瘤变的器官限制性肿瘤，而Ptenpc−/−；Smad4pc−/−模型发展为侵袭性腺癌。根据先前的研究结果，两种小鼠模型都具有免疫亚群的异质性浸润，与单缺失组相比，双缺失模型的特征为，CD45 /F480−LY6G 中性粒细胞显著增加（图4，A和B）。为了描述这些模型中的巨噬细胞，作者从前列腺肿瘤中分选出特异性巨噬细胞，并进行RNA-seq以确定其转录谱（图4C）。差异分析显示Smad4pc−/−转移模型（met_Mac）与来自Ptenpc−/−原位模型（oc_Mac）的巨噬细胞相比。转录发生改变，且MARCO上调（图4，D和E）。同时与脂质代谢和摄入相关的途径的上调（图4F）。 接下来，作者研究了单缺失和双缺失组中肿瘤内巨噬细胞的脂质含量。流式细胞术分析结果显示，与对照组相比，ADFP 脂质负载的TAM在前列腺肿瘤中浸润，而正常前列腺组织中几乎不存在（图4，G–I）。最后，为了进一步证实作者在原位PCa模型中的发现，作者使用了源自单缺失和双缺失前列腺上皮的PCa细胞系：Pten−/−细胞（nonmet细胞）来源于低侵袭前列腺腺癌，而Pten−/−；Smad4−/−细胞（met细胞）来源于晚期转移性腺癌。将两种小鼠PCa细胞系注射到受体小鼠前列腺的前叶，而侧叶注射盐水。注射后45天对肿瘤浸润情况的流式分析显示，负载脂质的巨噬细胞在met肿瘤肿块中浸润，在WT叶中缺失，而在nonmet组别中负载脂质的巨噬细胞含量很少（图4 J）。综上所述，与人类数据库结果相一致，负载脂质的TAM的浸润与小鼠PCa的肿瘤进展和转移存在相关性。图4. 
5. 相互作用的细胞因子信号驱动TAM脂质积累和PCa细胞迁移 为评估癌症细胞在体外促进骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中脂蛋白摄取方面的作用。作者在脂蛋白的存在下，将来自各种小鼠PCa模型的前列腺上皮细胞（CM）与BMDM孵育（图5A）。通过免疫荧光染色显示，当暴露于来自高侵袭性的CM时，BMDM显著摄取oxLDL（图5，B和C）。同时增加了Marco表达（图5D）。为了评估Marco在负载脂质TAM形成中的潜在作用，作者评估了Marco KO BMDM中的oxLDL摄取能力，并观察到与对照组相比，敲除组oxLDL摄取显著减少（图5，E和F）。接下来，为了阐明刺激Marco表达的细胞因子。作者发现在侵袭性癌症模型中，IL-1β、IL-23和IL-12p40水平升高，其中IL-1β含量最高（图S3，A和B）。并且，重组IL-1β在BMDMs中产生剂量依赖性的Marco表达增加（图S3C）；相反，抗IL-1β中和抗体降低了BMDM中oxLDL的摄取（图5G）。因此，这些结果表明，癌症细胞衍生的IL-1β驱动Marco上调，进而促进巨噬细胞的脂质摄取。鉴于载脂TAM是转移性PCa的一个关键特征，并且先前的研究表明TAM促进癌症细胞的侵袭和转移，因此作者测试了载脂TAMs调节癌症细胞迁移的能力。与对照组相比，与负载oxLDL的BMDM共培养后，癌症细胞的迁移增加（图5H）。为了鉴定载脂巨噬细胞分泌的因子，作者进行了蛋白质组分析。结果显示Ccl6在暴露于肿瘤条件的巨噬细胞中高度表达，并在oxLDL暴露后表达进一步增加（图5I）。同时，与对照组相比，抗Ccl6中和抗体可使载脂TAM导致的癌症细胞迁移能力显著降低（图5J）。上述结果表明，肿瘤条件下，巨噬细胞对MARCO依赖性的脂质摄取增加了Ccl6的释放，而Ccl6又促进了癌症细胞的迁移。图5. 
图S3. 
6. 高脂饮食会增加荷瘤小鼠TAM中的脂质积累并改变其转录谱 据报道，PCa进展与肥胖呈正相关，最近的研究结果表明，HFD会影响肿瘤细胞代谢，导致PCa小鼠模型中的肿瘤侵袭和转移。同时，TAM在HFD诱导的前列腺癌症进展中起着重要作用，但缺乏HFD直接影响巨噬细胞脂质代谢的实验证据。作者认为，癌症细胞可以促进TAM的脂质摄取，因此需要评估HFD是否会影响荷瘤小鼠浸润巨噬细胞的脂质含量。为此，在NOD-SCIDγ免疫缺陷小鼠皮下注射PCa细胞，其特征为缺乏B细胞和T细胞，NK细胞活性改变，但具有功能性髓系反应。在肿瘤发生的同时，将小鼠随机分为两个实验组，HFD组（45%脂肪）和正常脂肪饮食（NFD；10%脂肪）组，并额外监测25天的肿瘤生长情况（图6A）。结果显示，HFD组肿瘤生长进展更快，为脂质在推动PCa生长中的作用提供了实验证据（图6B）。与NFD对照组相比，HFD喂养小鼠中ADFP 巨噬细胞（负载脂质的TAM）显著增加（图6C）。此外，肿瘤中髓细胞亚群的流式细胞仪分析显示，HFD喂养小鼠的巨噬细胞受到干扰，巨噬细胞百分比显著增加（图6D），同时，巨噬细胞MHC-II表达减少，表明巨噬细胞活化发生了变化（图6E）。接下来，对来自NFD和HFD喂养小鼠的分选的肿瘤浸润CD45 CD11b F4/80 Ly6G-巨噬细胞进行RNA测序，结果显示HFD和NFD小鼠肿瘤中巨噬细胞的转录谱改变（图6F）。HFD分选巨噬细胞中的Ccl6显著增加（图6G）。差异表达基因的IPA结果显示，线粒体功能（氧化磷酸化）、脂质代谢（动脉粥样硬化信号、PPAR信号）和免疫调节（EIF2信号、粒细胞粘附、IL-10信号）相关通路上调（图6H）。上述结果表明，HFD可以提高PCa中负载脂质TAMs的丰度，并改变TAMs转录谱和分泌谱。图6. 
7. 阻断Marco可降低TAM中的脂质负荷，并抑制肿瘤生长和侵袭 由于Marco在调节巨噬细胞脂质积累和随后的癌症细胞迁移活动中的发挥重要作用，因此作者评估了αMarco中和抗体对肿瘤进展的影响（图7A）。结果显示αMarco治疗组肿瘤体积相对于对照组显著减小（图7B）。病理结果显示，αMarco治疗组中侵袭性肿瘤细胞比率显著低于对照组（图7C）。FACS分析显示，与对照组相比，αMarco治疗组中载脂ADFP F4/80 巨噬细胞的比率降低（图7D），免疫荧光实验也得到类似的结果（图7E）。同时作者还确定了αMarco治疗肿瘤过程中的巨噬细胞亚群的变化，表现为巨噬细胞的比率降低，MHC-II表达上调（图7F）。最后，αMarco治疗组显示细胞毒性CD11b NK细胞的百分比显著增加，表明NK细胞活化/成熟增加，表明NK细胞的含量增加可能有助于αMarco抗体的抗肿瘤活性（图7G）。由于异常的脂质代谢与某些抗肿瘤疗法的耐药性有关。所以作者研究了TAM中的脂质积聚是否有助于癌症的化疗抵抗。为此，在存在或不存在αMarco给药的情况下，将PCa细胞皮下注射到暴露于多西他赛的NOD-SCIDγ小鼠中（图7H）。与对照组相比，多西他赛和αMarco给药后肿瘤生长发生延迟。同时，多西他赛和αMarco的组合疗法进一步抑制了肿瘤生长（图7，I和J）。作者还观察到多西他赛给药与TAM的频率增加和浸润巨噬细胞上CD206的显著上调有关（CD206上调可能提示TAMs的肿瘤前激活状态）。而当αMarco与多西他赛联合给药时，这些效应得以恢复（图7，K和L）。综上所述，阻断Marco可降低肿瘤浸润巨噬细胞中的脂质含量，进而损害肿瘤生长和侵袭性，并改善PCa模型中对化疗的反应。图7. 
研究结论： MARCO是潜在参与PCa进展的TAM相关标记物，其定义了一个在人类PCa中具有预后意义的巨噬细胞亚群。Marco在调节巨噬细胞脂质积累和随后的癌症细胞迁移活动中的发挥重要作用，阻断Marco可影响TAM脂质代谢和癌症细胞迁移，并为晚期PCa提供新的治疗靶点。校对：李垚
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