【原】【LorMe成果】根际有益菌VOCs介导土传青枯菌的生存-致病权衡

LorMe青年 2023-02-01 发布于江苏

展开全文

近日南京农业大学资环学院LorMe实验室在土壤微生物与根际免疫方面取得重要突破，成果以“Bacterial volatile organic compounds attenuate pathogen virulence via evolutionary trade-offs”为题在国际微生物生态学权威期刊《The ISME Journal》上发表。该研究通过实验进化、土壤微生物比较基因组学与生理生化和分子生物学等手段，探究了青枯菌在有益菌挥发性有机物(VOCs)胁迫下，为增加其生存能力，而减弱青枯菌致病能力，从而保护植物健康。本研究为深入探究有益菌VOCs介导的根际微生物大联盟增强根际免疫能力，建立消减土壤生物障碍的生存-致病权衡策略提供的理论基础。

摘要

土壤细菌产生的挥发性有机化合物（VOCs）有很强的抗菌活性，具有抑制土传植物病原菌的潜力。目前VOCs对土壤微生态的影响已有大量研究，但其对病原菌进化的影响尚不清楚。本文通过连续传代培养实验研究了土传青枯菌在有益菌解淀粉芽孢杆菌T-5产生的VOC混合物长期影响下的变化，以及这些变化对青枯菌毒力的影响。研究发现，VOC胁迫使青枯菌对VOC的耐受性明显增强，同时对几种常见土壤细菌产生的抗生素的耐受性也显著增强。然而，不断提高的VOC耐受性迫使青枯菌在生存与致病间做出权衡，使青枯菌几乎完全丧失致病性。在遗传水平上，这些表型变化与编码脂多糖O-抗原（wecA）和IV型菌毛生物合成（pilM）基因的突变有关，这两种基因与外膜对抗生素的渗透性和致病力有关。本研究表明，有益菌VOCs是驱动病原菌权衡致病力的重要因素。

主要结果

一、解淀粉芽孢杆菌T-5的VOCs长期胁迫降低青枯菌种群密度

首先通过连续传代培养（图1A）探究长期在解淀粉芽孢杆菌T-5（以下简称T-5）的VOCs影响下青枯菌种群数量、生理特性以及基因的变化。设置了三个VOCs浓度，分别为低浓度（L-VOC）、中浓度(I-VOC)、高浓度（H-VOC），每隔两天测定一次青枯菌种群密度，结果发现与对照组（No-VOC）相比，VOCs存在会明显降低青枯菌的种群密度，并且VOCs的浓度越高，抑制效果越好（图1B）。

图1 实验设计模式图（A）和青枯菌种群数量随培养时间的变化情况（B）

二、长期T-5 VOCs胁迫增强了青枯菌对VOCs和抗生素的耐受性

为了测定长期T-5 VOCs胁迫是否会影响青枯菌对VOC的耐受性，研究团队测定了原始青枯菌、H-VOC和No-VOC处理后的青枯菌分离株对转接试验中的VOCs处理和五种纯VOC的耐受性。与原始和对照组（No-VOC）青枯菌相比，六个分离自H-VOC处理的青枯菌菌株中有五个对VOC的耐受性增强，当VOC浓度增加时，这种差异更大（图2）。此外，H-VOC处理后的青枯菌对纯VOC的耐受性比对VOC混合物的耐受性更强。而对照组（No-VOC）的青枯菌对VOC的敏感性与原始菌株相似（图2）。之后检测了分离株对土壤细菌常产生的三种抗生素的耐受性，结果发现H-VOC处理后的菌株的抗生素的耐受性也都有所提高，并且随着抗生素浓度的提高，这种差异更显著（图2）。

图2 对照（No-VOC）和H-VOC处理后的青枯菌与原始菌对VOCs混合物和五种纯VOC（苯并噻唑、壬酮、十一醛、十七烷和油酸）以三种抗生素（硫酸多粘菌素B、红霉素和利福霉素）的耐受性。

三、长期T-5 VOCs胁迫影响青枯菌生长-致病权衡

为了探究青枯菌对VOC耐受性的进化是否会导致生长与毒性相关特性的变化，研究团队测定了青枯菌的生长特性和毒力相关特性。结果发现，与原始菌相比，H-VOC和No-VOC处理下的青枯菌的最大种群密度、总生物量（生长曲线线下面积）都有所增加且缩短了停滞时长（图3A）。但是，H-VOC处理后的青枯菌的生长速率比No-VOC处理的青枯菌低，且停滞时间更长（图3A），这可能是由于对VOC的耐受性增加了生长成本。

对于青枯菌毒性相关的特性，研究结果发现相对于原始菌和No-VOC处理的青枯菌，H-VOC处理的青枯菌的几种毒性特征都明显减弱，包括群游运动能力、超氧化物歧化酶、生物膜形成和胞外多糖（EPS）的产生，但是H-VOC处理下的四株菌的泳动运动能力相对于原始菌有所提高（图3B）。团队也通过盆栽实验直接测定了青枯菌的致病能力，结果表明和原始菌与对照组（No-VOC）的青枯菌的致病力相比，H-VOC处理后的青枯菌的致病力降低（图3C）。这些结果表明有益菌VOC会选择出对VOC耐受性更强但致病力更弱的青枯菌。

使用主成分分析比较不同菌株所有毒力和生长性状，结果发现H-VOC处理后的青枯菌形成了一个独立的聚类（图3D）。此外，所有的毒性特征彼此之间都呈正相关关系，但与大部分生长特性呈负相关（除了生长速率和停滞期时间）（图3D）。这些结果表明高浓度VOC处理导致了青枯菌生长和毒性特征之间的权衡。

图3 长期VOC胁迫后分离的青枯菌的生长相关特征（A）、致病相关特征(B)、病情指数(C)以及主成分分析(D)

四、VOC导致青枯菌耐受性增强与致病力降低的分子机制

为了理解VOC耐受性和相关毒力性状变化的机制，研究团队对H-VOC和对照组（No-VOC）的青枯菌进行了测序。结果发现H-VOC处理的青枯菌都出现了糖基转移酶基因（wecA）的错义突变和IV型菌毛组装蛋白编码基因（pilM）的移码突变。此外，一小部分H-VOC处理的青枯菌的IV型菌毛分泌基因（pilQ）、葡萄糖蛋白B铁载体合酶基因（sbnC）转录调节基因（pehR）和鞭毛钩长度控制蛋白编码基因（filK）中存在错义突变（图4B）。通过构建wecA和pilM缺失的突变体再次测定其对VOCs的耐受性和致病力变化，发现突变体的VOCs耐受性提高且致病力降低，表明这两个基因确实和VOC耐受性提高和致病力降低有关。

图4 对照组（No-VOC）和高浓度挥发性有机化合物（H-VOC）处理的青枯菌的突变类型和数量（A）及两个处理中发现的突变基因和位点（B）

结论

土壤有益菌解淀粉芽孢杆菌T-5 VOC长期胁迫增强了青枯菌对VOC耐受性，并对土壤细菌常产生的几种抗生素的耐受性也显著增强。VOC耐受性的提高使青枯菌重新权衡生存与致病，导致青枯菌的毒性特征减弱、致病能力降低。在遗传水平上，这些表型变化与编码脂多糖O-抗原（wecA）和IV型菌毛生物合成（pilM）基因的突变有关，这两种基因都与外膜对抗生素的渗透性和植物病原菌的毒力有关。

全文链接：https:///10.1038/s41396-023-01356-6

作者简介：王佳宁，2018级博士研究生，主要研究内容为噬菌体和有益菌VOC对青枯菌致病能力的影响，在The ISME Journal、Soil Ecology Letter、土壤学报、农业环境科学学报等期刊上发表文章10余篇；获得国家留学基金委资助赴英国约克大学交流，期间参加Ecology Across Borders国际会议并作口头汇报。