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非侵入性脑刺激（Noninvasive brain stimulation，NIBS）技术，如经颅磁刺激或经颅直流和交流电刺激，被提倡作为认知神经科学实验中因果推理的措施。超越了相关性神经影像学测量和实验性感官刺激的局限性，它们允许通过实验操纵大脑活动并研究其对感知、认知和最终行为的影响。虽然这在原则上是正确的，但在以因果关系解释脑刺激实验时，建议特别小心。研究假设往往过于简单化，忽略了潜在的（隐含假设的）复杂的因果关系链，即刺激技术必须在脑组织中产生电场，然后唤起或调节目标区域和网络连接的远端区域的神经元活动，从而影响感兴趣的认知功能并最终导致行为测量的改变。重要的是，这个因果效应链中的每个环节都可能被几个因素所混淆，这些因素必须通过实验消除或控制，才能将观察到的结果归因于其假设的原因。由于许多中介和混杂变量不能直接观察到，并且剂量-反应关系通常是非线性的，因此情况变得复杂。我们将引导读者了解通用认知神经科学NIBS研究的因果关系链，讨论可能的混淆，并建议适当的控制条件。如果关键假设被明确测试（在可能的情况下）并且在实验上得到很好的控制，NIBS确实可以在认知神经科学研究中揭示因果关系。本文发表在Journal of Cognitive Neuroscience杂志。
非侵入性脑刺激（Noninvasive brain stimulation，NIBS）技术，如TMS或经颅直流和交流电刺激（TDCS/TACS），允许以时间和空间特异性的方式实验性操纵健康人脑中的神经元活动，从而克服电生理和神经成像技术中仅有的相关性研究。它们绕过感觉输入通道并直接影响大脑活动的能力使其成为研究神经元活动和认知功能之间因果关系的无与伦比的工具。在发明后不久，TMS已经被证明能够抑制视觉感知，到目前为止，TMS的“破坏性”或“干扰”效应在认知神经科学中有着悠久的传统，这遵循所谓的虚拟病变（virtual lesion）方法。后来，TDCS和TACS被发现是神经元活动亚阈值调节的方法，从而调节认知功能。尽管使用这些NIBS技术的认知神经科学研究经常声称要测试特定大脑区域或神经元活动模式对特定认知功能或行为的“因果相关性”，但潜在的因果关系很少明确。然而，为了证明这种因果推论的合理性，理论上假设的因果链，即从施加的刺激到观察到的行为变化，必须形成一个具体的实证实验。至关重要的是，这个因果链中的每个因果环节都可能被几个因素打断或混淆，最好通过实验消除或控制这些因素，以将观察到的结果归因于其假设的原因。我们将首先简要概述本文的核心要素：认知神经科学NIBS研究及其主要混杂因素的简化五步因果链。然后，我们将介绍使用NIBS的一般实验方法，并讨论认知神经科学中实验性NIBS研究案例的因果推理概念，然后逐步引导读者了解因果关系的五步链。之后，我们将更详细地讨论潜在的混杂因素，并回顾可用的实验对照条件以抵消它们，最后我们为设计有效的NIBS研究提供12个一般建议。 请注意，在本文中，因果推理仅意味着“推断因果关系”或“推断一个变量是另一个变量的原因”，这种推断可以基于对照随机实验，或者在某些情况下，仅基于观察数据。对后者研究的更一般介绍超出了本文的范围。虽然采用了这个特定的因果推理框架的元素，但本文仍然主要集中在经典的实验主义者通过实验操作推断因果关系的框架上。我们的主要目的是提高对NIBS研究中潜在的（通常是隐含的假设）因果链，它们的潜在混淆以及各自的实验控制措施的认识，鼓励进行精心策划和控制良好的NIBS实验，这些实验实际上证明了因果推断的合理性，即神经活动与认知功能之间因果关系的结论。 1.1 NIBS研究中的因果关系链 因果链（chain of causation）是指成对因果的不间断串联，通过许多中介变量从最初的感兴趣原因到最终的兴趣结果。鉴于大多数效应有许多原因，并且它们本身也会导致许多结果，因此这样的链仅代表整个因果图中的一个特定路径。因果图可以形式化为用指示因果关系的箭头连接的变量（A ➔ B），而不仅仅是关联性（A，B），左右变量代表特定因果对的因果关系。重要的是，没有最终的因果关系，要考虑的部分链完全取决于手头的研究问题。一旦假设定义了感兴趣的因果关系，连接它们的因果路径中的任何中间元素都被称为“中介（mediator）”。相反，与感兴趣原因（cause）相关的元素（即，引起它或仅仅与它共存但不是由它引起的）和影响感兴趣结果（effect）的因素被认为是混杂因素，因为它们对感兴趣结果的影响与感兴趣原因的影响混合在一起，阻止了因果影响直接归因于后者，从而无法通过因果图确定明确的因果路径。 NIBS研究中经常表达假设的水平如图1A所示。预计刺激会影响单个受限制的大脑区域，该区域对行为有影响，因为大脑区域与产生该行为有因果关系。在图 1B 中，我们提供了一个更详细的因果图，但为了便于理解，它仍然被简化和减少为关键变量（其中一些总结了多个较小的变量）。由红色箭头连接的红色元素表示从NIBS的应用到可观察到的行为效应的核心因果链。黄色框和箭头表示任务需求和当前大脑状态驱动局部活动和网络活动的因果途径，从而驱动各自的认知功能和行为反应。这种因果路径不仅是混淆的来源，而且在没有NIBS和感兴趣的认知功能的主要驱动力的情况下与任务表现有关。事实上，NIBS诱导的大脑活动本身不足以引起更复杂的认知功能，只能调节正在进行的与任务相关的神经元活动。黑色箭头表示最终影响主要因果关系链元素的其他因果关系，因此可能通过中央（蓝框）和外围（绿色框）非靶（off-target）刺激产生混淆。我们将从NIBS应用到行为的核心因果链分为五个因果对，如下所述：  箭头1：NIBS的应用通过经颅电-磁-电感应（TMS）或直接施用弱经颅电流（经颅电刺激[transcranial current stimulation，TCS]）在脑组织中产生电场。 箭头2：然后电场与神经元的膜电位相互作用，立即（在线）唤起神经元放电（TMS）或调节目标大脑区域局部自发放电（TCS）的阈值，激活特定的皮层内回路模式（motifs）和相关神经元特征。在离线TMS/TCS协议的情况下，它另外触发突触可塑性的过程。 箭头3：如果将目标网络节点的输出神经元驱动到超阈值水平，则局部神经元活动通过皮层间轴突投影跨突触扩散到目标网络的其他连接大脑区域，激活大规模和远程回路motifs以及突触强度的远程变化。 箭头4：对局部和大规模回路motifs的直接（在线）或随后（离线）影响可以干扰或促进介导感兴趣的认知功能的特定任务相关神经元计算，这反映在结果的各自变化或这些过程的完成时间。 箭头5：关于在特定行为任务的背景下施加的运动反应，这些改变的认知过程最终导致错误率或RTs的变化。
尽管NIBS经常被描述为一种手段，通过它可以简单地“关闭”或“敲除”整个大脑区域或逼真地模仿内源性振荡活动，但现实情况更为复杂，在选择特定技术来操纵特定研究中的神经元活动之前，需要考虑特定技术的作用机制和适用性。虽然TMS和TCS通常被混为一谈，称为“NIBS”，但它依赖于不同的神经生理学作用原理。由TMS引起的快速变化，高振幅的电场梯度（<300μs）足以使皮质神经元的膜电位完全去极化，导致动作电位（action potentials，AP；超阈值刺激）的立即出现。相比之下，由TCS引起的弱得多的恒定或交替电场被认为只是将神经元的膜电位稍微向去极化或超极化移动，从而调节AP自发出现的可能性（亚阈值刺激）。这种根本差异对分别适用于TMS和TCS的实验方法具有重要影响。经颅超声刺激是另一种有前途的NIBS神经调节技术，由于其能够刺激大脑深处非常有限的体积，同时保留覆盖的组织，因此最近受到越来越多的关注，并且可以预期在不久的将来修改NIBS工具箱用于人类应用。经颅超声刺激不是基于电场的感应，而是可能涉及聚焦声压波对神经元膜和/或离子通道的机制影响，本文范围内不讨论。 2.1 使用NIBS的实验方法 根据它们特定的刺激参数，TMS和TCS不仅能够在刺激期间发挥即时（在线）效果，而且能够在刺激本身持续数分钟至数小时后发挥后续（离线）效应（图2）。评估对刺激的即时神经反应的在线方法可用于：（i）量化皮质兴奋性或连通性等特性及其大脑状态调制情况（包括任务参与度；图2A），（ii）干扰正在进行的任务相关或自发神经元活动，从而干扰认知（图2B），（iii）更温和地调节神经元活动的水平（“门控gating”）和时间（“夹带entrainment”）从而调节认知功能（图2C）。相比之下，离线方法可通过突触可塑性机制用于（iv）抑制或（v）促进神经元兴奋性，评估其对神经元活动和认知的后续影响（图2D和E）。虽然依赖于不同的神经生理机制，但在线干扰和离线抑制方法都被称为“虚拟病变”，并且最常用于认知神经科学中，以测试皮质区域是否以及何时与认知功能“因果相关”。在线调制还允许研究哪些神经元模式（例如振荡频率）正在介导或支持特定的认知功能。虽然TMS适用于所有这些方法，但弱得多的TCS不能用于定量（因为它不会触发AP），也几乎不能用于干扰。相比之下，它最适合在不中断的情况下进行调制，并且可以产生持久的离线效果。我们将看到皮质兴奋性的净增加和减少（在线和离线）。  （A）在线定量：一种足够强的刺激，可以直接输出目标区域/网络（使用TMS，而不是TCS），允许通过运动诱发电位或磷蝶报告（phosphene reports）来量化皮质兴奋性。 （B）在线干扰：干扰正在进行的与任务相关或自发的大脑活动（使用TMS，而不是TCS）。 （C）在线调节：对神经元活动的水平（通过低强度TMS或TDCS“门控”）或时间（通过TACS或节律性TMS的“夹带”）进行适度调制，与正在进行的任务相关或自发神经元活动相互作用而不会中断它。 （D）离线促进：皮质兴奋性的增加（由重复的TMS [repetitive TMS，rTMS] 或延长的TCS触发），可能是通过被刺激突触的长时程增强介导的。 （E）离线抑制：皮质兴奋性降低（由rTMS或延长的TCS触发），可能是通过受刺激突触的LTD介导的。
因果推理是指在假设的“因”发生变化后，根据观察到的效应变化来推断因果关系的过程。与通过条件概率 P(effect|cause) 推断两个变量的单纯关联相反，因果推理为它们的关系分配了一个方向，假设对“因”的积极操纵，而其他一切都保持不变，产生结果，但反之则不然。在NIBS的背景下，一个简单的例子是，初级运动皮层（M1）手部区域的TMS（具有足够的强度）导致对侧手指约20毫秒后运动或至少增加其运动可能性，但自发的手指运动不会影响TMS发生的可能性。事实上，这种不对称性适用于因果链中介导从TMS脉冲到手指运动的每个因果对（即，TMS脉冲➔电场➔ M1 Layer 2/3或前运动皮层中皮质神经元的APs➔脊髓神经元中的APs➔肌肉APs➔肌肉收缩➔手指运动）。对于认知神经科学研究中的行为任务表现，因果链通常更为复杂，对于图1B中的因果图，为了简化起见，许多单个步骤已合并为几个类别。 3.1 使用无创神经影像学绘制相关关系 在神经影像学研究中，感兴趣的认知功能在实验上被隔离为各个任务条件之间的唯一差异，而相关的神经活动被评估并在条件之间进行比较。尽管如此，认知功能和大脑活动之间的因果方向并不容易从这些实验中得出。在试图避免对身心问题采取任何特定的哲学立场时，为了便于论证，我们将在这里假设认知功能因果关系取决于特定的神经元基质（即结构）和它产生的神经元活动的时间空间模式。这不应被误解为对心理因果关系的二元论观点，因为“认知功能”不是指有意识的、现象性的经验或精神状态，而是实用地指信息处理的机制和最终产生某种行为的计算。从这个角度来看，认知神经影像学实验使参与者参与一项任务，该任务需要招募某些神经元网络和机制来实现相应的目标认知功能，同时测量大脑活动作为任务条件的函数。然而，由于并非所有相关的大脑活动都可能因果关系地促进任务所从事的认知功能，因此测量的神经元活动不能明确地作为其原因，而仅仅是其神经元相关。 3.2 使用NIBS绘制因果关系图 当使用NIBS操纵大脑活动而不是仅仅通过神经成像观察大脑活动时，可以解决因果方向的这种模糊性，同时测量行为任务表现作为认知功能完整性的代表。因此，与NIBS相关的行为变化主要可以解释为实验诱导的大脑活动变化的因果效应。当单独的NIBS足以产生运动行为或感知现象时，例如分别由初级运动和视觉皮层TMS后的运动诱发电位（motor-evoked potentials，MEP）或光幻觉（对光的虚幻感知）量化肌肉反应。对于这些病例，可以采用在线定量方法（图2A）来证明各自大脑结构中的神经元活动（例如，TMS诱导的M1中皮质脊髓运动神经元的放电）与行为结果（例如，对侧手部肌肉的收缩）之间的明确因果关系，甚至可以确定剂量-反应关系（例如，与TMS强度增加和MEP振幅增加相关的sigmoidal形函数）。然而，对于人类的NIBS，大多数其他大脑靶点不会导致明显的输出。相反，需要行为任务来参与感兴趣的认知功能及其神经元相关性，同时在任务前（离线；图2D和E）或任务期间（在线；图2B和C）使用NIBS，揭示其对这种认知功能的因果贡献。这让我们回到了本文的核心：认知神经科学中NIBS研究默认的因果链及其许多可能的混杂因素使NIBS结果的因果解释复杂化（图1B）。在接下来的部分中，我们将逐步引导读者了解因果路径，并讨论每个步骤，在哪些条件下可以假设因果关系。之后，我们将描述这些因果关系如何被变量混淆。只有在建立不间断的因果链而不混淆各个环节的原因时，才能得出“X区域的神经元活动导致行为Y”的结论。
第一个成对因果（箭头1）通常被隐含地假设，无需进一步讨论，即：应用的NIBS技术在目标大脑区域产生所需强度，范围和方向的电场，而不会影响非目标大脑区域，也不会无意中影响与刺激相关的其他因素。这第一个关键步骤远非微不足道，由于许多原因，仅仅在假定的目标区域上放置TMS线圈或连接TCS电极是不够的。 4.1 确定靶点 在我们尝试刺激感兴趣的特定目标位点之前，我们需要确定它的位置。根据NIBS方法的空间特异性，这些目标很容易被低估或过度指定。对于TMS，有效电流密度被限制在小于一立方厘米，并且诸如“后顶叶皮层”或“背外侧pFC”之类的靶点非常不特异，因为（i）大多数大脑区域的功能组织在地形上更细粒度，（ii）只有一部分解剖结构会受到有效刺激。相比之下，对于TCS，即使是整个大脑区域也很难被孤立地刺激。无论NIBS技术的空间特异性如何，目标部位都可以主要根据：（i）其功能，（ii）其神经解剖位置，或（iii）甚至其相对于颅骨的位置来确定。功能性TMS定位器可分别基于MEP和光幻确定运动或phosphene热点。这种方法具有高度特异性，因为它允许根据输出变量的即时反馈微调线圈定位，确保有效地刺激预期的神经元群。但是，这种方法仅适用于极少数靶点（即运动和视觉皮层）。第二好的选择是通过fMRI定位器，例如，从隐蔽的空间注意力任务中确定FEF。虽然不提供线圈方向的信息，但可以根据单个被试统计图确定目标体素。对于与可识别的解剖位置紧密相关的功能，可以使用单被试的结构MRI扫描来识别靶点坐标，但允许该区域内相当大的不确定性。当忽略结构——功能关系中的个体间变异性时，可以在单被试结构MRI的帮助下将它们转换为原始空间后使用文献中的标准坐标。当完全忽略单被试大脑解剖结构时，10-20 EEG电极系统可用于粗略估计特定大脑区域的位置（例如，左背外侧pFC的F3或右后顶叶皮层的P4）。系统比较表明，随着上述方法的个体化减少，观察显著效果所需的参与者数量急剧增加。重要的是，除了TMS定位器和10-20系统之外，所有方法都需要MR引导的立体定向神经导航设置，从而将TMS线圈定位在目标部位上，这被认为是在实验疗程内和跨实验疗程中保持线圈位置的最新技术。
第二个因果对（箭头2）是指电场对局部神经元活动的影响。为了简单起见，为了防止图1B中的因果图过载，这里的局部神经元活动也指继发于初始神经元反应的效应，例如局部回路motifs的激活，神经元兴奋性的变化，局部神经元振荡的夹带和局部突触可塑性。因此，关键问题不仅在于应用的电场是否直接激发目标大脑区域中的局部神经元元件，还在于它是否产生了所选实验方法所需的特定神经元效应（图2）。尽管对TMS和TCS的神经元效应有一些主要的了解，但将非侵入性电生理和神经成像技术与NIBS相结合可以帮助验证特定实验是否成功诱导了所需的神经元效应。 5.1 诱导局部神经元活动的即时（在线）效应 膜极化可能是TMS和TDC的主要作用机制，尽管已经讨论了其他机制。对于TMS，电场动力学足够快和强，可以将神经元膜去极化到超阈值水平，大概是在轴突或轴突末端的水，达到AP出现并沿膜扩散的程度。然后，这些AP通过谷氨酸和GABA-A/GABA-B受体通过跨突触影响连接的神经元，引起兴奋性和抑制性突触后电位，具体取决于最初的去极化神经元类型。突触后电位的空间和时间整合会导致兴奋性和抑制性突触后神经元放电。尽管已经使用初级运动皮层的配对脉冲协议对 TMS 做出反应的皮质内回路进行了非常详细的研究，并且在啮齿动物或非人类灵长类动物的工作中产生了一些见解，但在大多数人类皮质区域中激活的特定回路motifs只能推测。无论如何，TMS唤起整个皮层内回路的高度同步的神经元反应，不仅因为电场最初使大量不同的神经元去极化，还因为激活在它们之间扩散。因此，TMS后神经元群或大脑区域内将同时存在兴奋和抑制，并且对其兴奋性或信息处理能力的净影响是复杂的（如箭头4所讨论的那样）。 对于TCS，电场要弱得多，并且假设只是将膜电位略微向去极化或超极化移动，从而在亚阈值尺度上改变神经元兴奋性，要么是持续（TDCS），要么是有节奏的（TACS）。人类标准刺激强度（1-2 mA）诱导的电场远低于小鼠或猴子，因此TCS在人类中的有效性备受争议，尽管TCS诱导的电场小至0.2-1 V / m已被证明可有效引起自发神经元放电率的微小变化。虽然很小，但TCS诱导的电场很宽，并且其影响可能会在大型神经元群中累积。同样，整个回路将直接受到电场的刺激和通过突触连接的间接刺激，但与TMS相比，反应将不太同步，并且更强烈地依赖于持续的大脑活动。重要的是，电场在细胞水平上对不同神经元结构的影响取决于它们的形状和它们与大脑的方向，因此非常复杂，对给定神经元的净效应取决于去极化和超极化的整合。更重要的是，对整个大脑区域的净效应来自单个神经元兴奋性变化的整合，突出了TCS极性与目标大脑区域由此产生的净兴奋性变化之间不可能有简单的关系。 5.2 量化兴奋性和连通性 通过TMS诱导的MEP或光幻对运动或视觉皮质兴奋性的量化是靶神经元超阈值刺激的固有证据（图2A）。有许多研究优雅地使用MEP或光幻测量来证明在各种任务条件下运动或视觉皮质兴奋性的调节。使用双线圈TMS，可以以任务相关的方式评估与这些大脑区域的效应性连接。然而，这些研究通常以相关方式使用NIBS，并且不探讨大脑活动对认知的因果影响。 5.3 干扰自发或与任务相关的神经元活动 许多经典的认知神经科学TMS研究旨在干扰特定大脑区域的任务处理（在线）期间的神经元活动，以证明其与认知功能的因果相关性（图2B）。然而，我们对实现特定计算的大多数神经元活动模式缺乏精确的理解，因此不知道到底要干扰什么。因此，用于干扰的TMS通常使用高强度单脉冲TMS，以良好的时间分辨率为目标，从而产生短的干扰或高频短TMS bursts（主要是10-20 Hz），覆盖数百毫秒，以确保神经元处理的足够长的中断。尽管局部回路中TMS诱发的神经元活动很复杂，但可以安全地假设TMS（i）激发随机神经元件（相对于电场最佳定位的神经元件），包括那些未被任务激活的神经元件；（ii）导致随后抑制神经元活动，包括在初始激发后（约50-150毫秒）由任务激活的神经元，可能是因为GABA-B受体介导的抑制，与皮质沉默期的运动皮质现象和长时程皮质内抑制平行；（iii）基于在相对较大的神经元群中人工诱发的时间锁定兴奋-抑制模式，在目标区域中引起高度同步的神经元活动。我们将讨论这些神经元效应对介导箭头4认知的神经元计算的可能影响。尽管刺激强度和频率可能是确定成功干扰方案的关键参数，但尚未对刺激强度、频率和训练持续时间进行系统比较，以说明它们对干扰协议的主要适用性。 5.4 调节（“门控”）神经元兴奋性 在线TDCS通常被认为在任务期间调节某个大脑区域的兴奋性，其基本原理是促进与任务相关的神经元处理（图2C）。动物工作确实显示出自发神经元尖峰的极性依赖性调节。然而，鉴于神经元兴奋性变化的复杂性，在人类中，阳极和阴极TDCS通常不能等同于初级运动皮层（M1）外的兴奋性增加和减少。这个问题对于经颅随机噪声刺激来说得到了一定的解决，该刺激由各种频率（特别高，>140 Hz）TACS组成。即使对于固定极性，TCS也无法观察到简单的剂量——反应曲线，并且这些非线性效应使确定适当的刺激剂量变得复杂。无论这些挑战如何，一个值得注意的方法是在学习任务期间诱导兴奋性变化，以控制学习诱导的突触可塑性，这可能导致长期影响，不是由刺激而是与学习相关的可塑性引起的。这种方法通过与任务相关的高度特异性回路的激活，有效地提高了TCS的低解剖精度。 5.5 夹带神经元活动（和振荡） 一定频率的节律性TMS或TACS用于夹带神经元活动，目的是同步和增强内源性脑振荡（图2C）并测试它们对认知的因果作用。然而，潜在的神经生理学假设往往没有明确说明。EEG /脑磁图（magnetoencephalography，MEG）中的神经元振荡反映了具有平行定向树突的大型同步神经元群的总电位/场。当更多神经元的突触后活动变得同步时，它们的振幅增加，并且节律性NIBS对神经元振荡的夹带通常是指自发但独立振荡神经元的同步。然而，也有可能随机神经元活动被夹带，而不是已经持续的内源性振荡。夹带也可能对TMS和TCS有不同的作用。虽然节律性（超阈值）TMS可能直接唤起同步激发和抑制波，但可能会重置现有的振荡活动，TACS只是前后移动膜电位，偏向自发神经元放电。因此，TACS的较弱影响可能需要它更具针对性，例如，根据目标振荡的个体频率进行调整。不幸的是，由于强烈的NIBS相关伪迹，目前很难甚至不可能直接证明节律性NIBS期间神经元夹带。然而，已经有一些成功的尝试使用更间接的神经元夹带测量。请注意，TACS后振荡功率的任何持久增加都反映了振荡产生回路中的突触后效应（离线），而不是夹带活动本身的持续。 5.6 基于突触可塑性在局部神经元兴奋性中诱导后效应（离线） 重复性TMS（Repetitive TMS，rTMS）或延长的TDCS可以在神经元兴奋性中产生瞬时变化，由突触可塑性介导，并且比刺激方案本身持续数分钟至数小时（图2D和E）。已经为M1开发了几种NIBS协议，根据MEP振幅的索引，皮质脊髓兴奋性产生双向变化，主要取决于rTMS的频率或模式或TDCS的极性。原则上，经典的高频（∼5 Hz）与低频（∼1 Hz）rTMS分别导致长时程增强（long-term potentiation，LTP）和长时程抑制（long-term depression，LTD），促进和抑制皮质脊髓兴奋性，而对于θ爆发刺激，TMS训练和暂停（trains and pauses）的特定时间决定了效果的方向。同样，经典M1的对侧前额蒙太奇中的TDCS分别产生皮质脊髓兴奋性的持久增加和减少，这取决于阳极或阴极是否覆盖M1。刺激强度和持续时间是TMS和TCS离线效应的关键决定因素。然而，Bonaiuto和Bestmann（2015）强调“滑动尺度原理（sliding-scale rational）”（假设皮质兴奋性的大小随着刺激强度的增加而增加）是不正确的，因为即使是M1也已经清楚地证明了非线性。重要的是，这些后效应显示出较大的个体内和个体间变异性，通常以一定的延迟出现，并在未知的持续时间后消失，通常为30-60分钟）。虽然NIBS的有效性可以通过M1的MEP振幅立即评估，但其他脑区的响应需要神经成像技术（见下文）。虽然是常见的做法，但我们不能假设每个NIBS协议都可以轻松地从运动区域转换为非运动区域，并且如果没有操作检查，我们只能希望在目标区域发生所需的兴奋性效果。 5.7 用神经成像绘制NIBS相关的神经元效应 在线和离线NIBS效应都可以通过无创神经影像学技术（例如，fMRI，EEG或MEG）在人类中进行评估。神经影像学对于提供靶点激活的证据至关重要，即验证所应用的NIBS协议已有效诱导目标区域中预期神经元活动的假设。BOLD fMRI的高空间分辨率有助于通过静息态或任务fMRI检测自发或任务相关神经元活动的净变化，但为了证明夹带或干扰效应，通常需要EEG或MEG的优越时间分辨率。神经影像学还允许筛查非靶脑区域的意外共激活，否则可能会导致混淆并阻止结构——功能关系的明确识别（参见箭头3和4）。在没有行为效应的情况下，神经元活动可能是研究网络效应（如补偿）的唯一读数（参见箭头3），而在存在行为效应的情况下，脑行为相关性可能进一步证实NIBS诱导的神经元和行为效应在剂量反应关系方面的因果关系。
第三个成对因果（箭头3）是指NIBS诱导的局部神经元活动对目标网络其他连接节点的影响。这种激活的扩散可能是需要的或被认为是潜在的混淆，但无论如何，它都是大脑的固有特征，而不是该方法的缺点。当将认知功能的变化归因于NIBS诱导的目标大脑区域的变化时，始终需要考虑网络效应。 6.1 NIBS的远程效应 跨突触扩散的最直接证据是M1的TMS后的MEP，它依赖于M1中最初兴奋的神经元通过皮质脊髓输出神经元和脊柱运动神经元到肌肉的几个突触连接。然而，NIBS-fMRI联合研究已经证明了皮质-皮质扩散，该研究表明TMS对各种运动和认知功能网络具有很强的远程效应。同时进行的 TMS-fMRI 研究将 TMS 应用于 M1、FEF 或顶内沟，发现在偏远但解剖学上连接的皮质和皮质下区域具有强烈的（剂量和状态依赖性）效应，即使是亚阈值强度。同样，同时和连续TCS-fMRI研究报告了广泛的BOLD效应。然而，对于TCS，直接的非焦点刺激效应（即，广泛的电场对目标区域外神经元活动的直接影响）很难与实际的网络效应（即，局部电场诱导的神经元活动变化通过远程轴突投影和突触连接传播到偏远区域）分开。此外，同时进行的TMS-EEG研究报告了TMS诱发的电位在目标网络中扩散，双线圈TMS研究通常在测试两个大脑区域之间的效应性连接时使用。神经影像学可用于读出通过突触可塑性介导的即时（在线）效应以及随后（离线）效应。然而，对于远程神经元活动的后效应，问题仍然存在，它们是否由靶点的局部突触可塑性引起，随后通过功能连接的变化或通过刺激期间活动扩散诱导的远程部位本身的突触可塑性影响远程活动。 6.2 对网络活动的影响 在任何情况下，远程节点上的在线和离线效果在功能上都是相关的。例如，在连续的TMS-fMRI研究中，rTMS诱导的受刺激区域对远程节点的抑制作用的增加预测了语言任务中个体TMS诱导的反应延迟。因此，抑制刺激效应不仅限于刺激区域，而是可以影响网络的大部分，还调节其功能相互作用。如果使用单点TMS或TCS，这种远程网络效应仍然隐藏在纯粹的行为研究中，并且在得出有关给定任务的刺激区域的因果相关性的结论时通常被忽略。然而，网络效应是潜在的混杂因素，特别是当依赖可塑性诱导的离线协议时，这些协议使大脑有时间进行适应性可塑性，以响应网络的干预和快速的短期重组。请注意，在网络的不同部分，远程效应可以是抑制性的，也可以是促进性的，或者两者兼而有之，并且网络效应的方向很难先验地预测。NIBS诱导的关键目标节点抑制有时会降低网络中与任务相关的活动，这反过来又抑制并增加了其他网络节点的活动，从而补偿了中断并防止了行为影响。这种补偿性上调可能发生在对侧同源区域，同侧网络节点以及与其他认知功能相关的邻近区域。这种应对局灶性破坏的短期重组强调了资源灵活再分配的强大潜力。将NIBS与神经成像相结合提供了一种在系统级别映射本地和远程网络效应的方法，并将这些效应与行为变化联系起来。
第四个成对因果（箭头4）是指从神经元网络活动到认知效应的转变。后者不能直接观察到，但必须作为一项特定任务进行操作，通过行为表现进行评估。重要的是，大脑活动与认知功能没有一对一的映射，因为同一区域可能涉及多种功能，而相同的认知功能依赖于多个区域的相互作用。此外，NIBS协议可以影响网络活动和认知功能之间的相互作用，但很少产生直接的行为输出。因此，本节的主要问题是，本地和网络活动的期望调节是否会影响它所假设介导的目标认知功能。在线和离线NIBS方法都可以促进或抑制认知功能（图1B），尽管因果发现本身（例如，皮质区域X而不是Y与认知过程A而不是B有因果关系）可以独立于对因果关系的方向，大小或特定功能的估计，后者对于理解认知功能背后的神经元机制和开发基于理论的应用至关重要。因此，对于给定的NIBS协议，认知功能和实验设置，先验地预测诱导效应的方向和大小可以被认为是一个关键的挑战。 7.1 使用NIBS损害与改善认知功能 认知神经科学中的许多NIBS研究依赖于“虚拟病变”方法来绘制给定大脑区域中的神经元活动与感兴趣的认知功能之间的因果关系，假设通过在线或离线NIBS协议干扰或抑制与任务相关的神经元活动将导致所研究的认知功能的损害。在线干扰方法（图2B）旨在在任务执行期间用TMS暂时干扰认知功能，而离线抑制方法（图2E）依赖于任务期间皮质兴奋性的降低。在这两种情况下，预计任务性能都会下降。然而，术语“虚拟病变”具有误导性，因为TMS不会简单地关闭大脑区域，离线和在线方法依赖于不同的神经元机制（参见箭头2）。此外，“虚拟病变”只能解释性能障碍，对“抑制”方案的反应的改进通常被称为“矛盾促进（paradoxical facilitation）”。证明大脑区域或神经元活动模式与给定认知功能的因果相关性的另一种理由是在任务执行期间促进它并显示对性能的积极后果。同样，这通常通过在线调制（图2C），通过节律TMS或TACS夹带与任务相关的振荡，或在任务期间通过TDCS增加即时皮质兴奋性，或通过离线促进（图2D）进行尝试。NIBS诱导的行为促进很诱人，因为它为治疗应用或神经增强开辟了有趣的途径。重要的是，为特定研究选择NIBS协议通常建立在过于简化的假设之上，这部分解释了许多零发现和有争议的结果。下面，我们将讨论将神经元转化为认知效应的可能作用机制，并重点介绍一些调节因素。 7.2 通过在线TMS损害认知功能 实现这一目标的最有效方法可能是通过TMS进行在线干扰（图2B），这可能建立在三种神经元效应之上（参见箭头2）。首先，随机神经元的初始激发在受刺激回路中引起神经元噪声。噪音弥漫在神经系统的所有信息处理层面，从受体信号转导到行为反应。噪声的人工感应可能会损害或延迟与任务相关的神经元计算，因为神经活动需要采样更长时间以区分信号和噪声。其次，初始兴奋不可避免地伴随着GABA-B-能反馈抑制，在TMS后抑制神经元活动约50-150毫秒，中断和延迟神经元处理，甚至在关键处理步骤中导致信号丢失。这种效应可能最接近沉默神经元活动的“虚拟病变”想法。第三，诱发的激发-抑制序列人为地同步更大的神经元群，从而降低网络中可能的神经元活动模式的数量。局部神经元活动中熵的损失降低了同步网络的信息表示能力，导致任务相关信息的退化和神经元计算的中断。这可能会导致处理时间延长（因为需要补偿迭代或招募额外的处理资源），甚至导致计算结果不正确。重要的是，与离线方法相比，在线中断不会为功能重组留下目标网络时间，这可能会导致更强的刺激效应并简化结论。 7.3 通过在线TACS或TMS夹带改善认知功能 为了积极改善与任务相关的功能，需要对神经元的作用机制进行特定的假设。相对简单的目标是神经元振荡，这据说是各种认知功能的基础。为了通过节律TMS或TACS（图2C）的相位在线调制来夹带神经元振荡，不仅需要明确大脑区域或网络，还需要明确振荡频率。当能够经颅夹带（和增强）神经元振荡从而改善认知功能时，这证明了其因果相关性。然而，同步的增加是否有益取决于振荡介导相关神经元计算的机制。超越单纯的兴奋性波动，振荡据说可以实现更复杂的过程，例如跨频通信，相位编码，以及潜在的相位依赖性可塑性。这些复杂的过程更难优化，尽管（多焦点）TACS已成功用于产生行为相关的区域间同步和工作记忆增强。然而，同步的增加，也可能无意中招募与任务无关的神经元，或者夹带诱导的内源性振荡相移也可能不利于与任务相关的神经元计算。有趣的是，相同的TMS协议（例如，10或20-Hz TMS的四到五个脉冲串）通常用于行为干扰和神经元夹带，例如α或β振荡活动，以及TMS爆发是否损害或改善认知功能可能因此取决于目标网络中节奏同步的大脑活动是否有利于任务。 7.4 通过在线或离线NIBS双向调节（门控）认知功能 与破坏或积极驱动介导认知功能的神经元过程相反，通过TDCS（图2C）的强直在线调节假设能够双向调节（减少或增加）与任务相关的神经元活动，具体取决于刺激极性（以及其他因素）。正如箭头 2 所讨论的，TDCS 极性、强度和净兴奋性变化之间没有直接的关系。对于任何给定的NIBS协议，也没有从皮质兴奋性到认知表现的简单映射。可以想象，介导任务相关计算的回路中的净兴奋性增加会增强与任务相关的信号，从而提高信噪比（SNR）。或者，增加的兴奋性也可能增加自发但与任务无关的活动，从而增加噪声并降低SNR。同样的歧义也适用于兴奋性降低。重要的是，尽管额外的噪声可能会降低与任务相关的SNR，以获得经过良好调整的神经元表示，从而损害任务性能，但噪声可能对其他任务有益。在线NIBS的实际效果取决于自发和任务诱导的大脑状态，特定任务需求，参与者特定特征和刺激参数的复杂相互作用。 类似的考虑也适用于通过离线TMS或TCS协议抑制或促进的基本原理（图2D和E），尽管离线NIBS后皮质兴奋性的双向调节基于不同的神经元机制（参见箭头2）。靶点网络中突触的LTP样强化或LTD样弱化仅间接导致神经元兴奋性的后续增加或减少以及自发和任务相关神经元活动的相应变化。还应该注意的是，离线效应双向性的证据几乎完全基于M1刺激后MEP振幅的各自调制，并且可能不容易推广到其他蒙太奇和皮质区域。重要的是，在线调节的效果，兴奋性变化在目标脑回路内并不均匀分布，因为只有随机选择的功能异质突触受到影响。尽管可能净促进或抑制兴奋性，但任一方向的随机变化最有可能在这些回路产生的神经元活动模式中产生噪声，对任务性能产生上述积极或消极后果。这些考虑因素与NIBS的训练研究和治疗应用高度相关，NIBS通常假设离线NIBS诱导的促进以改善随后执行的任务中的行为。 7.5 矛盾促进的悖论（the paradox of paradoxical facilitation） “矛盾促进”通常是指“干扰”或“抑制”NIBS协议对认知功能的意外积极影响。如上所述，噪声是解释NIBS协议认知影响的核心概念。考虑到随机共振，向人脑等非线性系统添加噪声可能会产生相反的效果。而适量的噪音可以增加亚阈值刺激的微弱神经元信号，将其提升到阈值以上，并导致行为促进，超过噪声水平可能会掩盖与任务相关的神经元信号。重要的是，NIBS诱导的活动或神经噪声不是完全随机的，也不独立于任务诱导的神经活动或大脑状态。因此，根据激活的神经元群，诱导的活动甚至可以被视为噪声和信号的一部分。如果诱导的神经元噪声与正在进行的相关活动同步，它可能会增强信号。换句话说，行为促进可能是由系统中的最佳噪声水平引起的。虽然最初用于在线TMS研究，但这些原则也适用于离线TMS和TCS协议。事实上，在任务处理之前应用的离线NIBS可能会暂时将刺激区域中的活动启动到促进后续任务执行的水平，尽管稳态亚可塑性可能导致相反的效果。最后，刺激诱导的远距离连接区域的去抑制可以促进认知处理。 然而鉴于任务、大脑状态、刺激协议和强度之间的复杂相互作用，在大多数认知神经科学实验中，给定的NIBS协议平均导致行为障碍或促进的确切情况仍然未知，上述解释主要以事后方式使用。甚至可以想象，在某些情况下，例如，由于神经元噪音增加，NIBS对认知表现影响的真正方向因参与者而异，甚至在试验的参与者内部也是如此。在这种情况下，即使缺乏明确的方向，NIBS后变异性的增加（超出测量噪声）也可以被视为因果关系的证据。然而，这种关系对认知功能背后的神经元机制的信息较少，并且更难用于治疗应用。 各种NIBS诱导的神经元效应可以影响与任务相关的神经元计算，尽管对使特定神经元过程易受这种影响或对这种影响具有鲁棒性的因素知之甚少。NIBS效应通常很小，大脑能够补偿微弱的干扰，可能导致许多NIBS研究中观察到的零效应。 7.6 研究网络交互的多站点方法 由于所有认知功能都依赖于在大规模神经网络中组织的分布式过程，因此人们越来越有兴趣以同时或随后的方式破坏给定功能的多个网络节点，以研究刺激诱导的网络对认知功能的影响。多焦点TMS可以提供对功能网络相互作用的见解，并阐明其补偿潜力。功能相互作用可以通过同时靶向多个区域（“多站点”方法）或通过结合不同区域的离线和在线TMS（“条件和扰动”方法）来在线研究。多位点TMS方法特别适合绘制几个大脑区域中断的直接后果，因为任务执行期间急性TMS诱导的干扰使系统没有时间发展适应性可塑性。这允许测试一个区域的干扰效应是否可以通过同时破坏其他关键区域来增加。以互补的方式，条件和扰动方法可用于研究快速网络重新分配和补偿。它将离线调制的可塑性后效应与在线干扰的即时扰动效应相结合，其基本原理是，一个区域的离线调节可能会使另一个网络节点对在线干扰的破坏性影响敏感。在某些情况下，单个目标区域的离线调节不会影响与任务相关的行为，而第二个区域的额外在线中断有效地损害了任务性能，揭示了离线协议的破坏性影响。一个可能的解释是，这两个区域都有助于感兴趣的功能，并且一个区域的离线调节可以通过另一个节点的更强贡献来补偿，从而改变它们在网络中的功能权重。额外的在线扰动增加了整体“病变负荷”，从而导致认知障碍。当与神经成像相结合时，条件和扰动方法也可用于研究网络水平的快速重组。O'Shea等人（2007）证明，在动作选择任务期间，左侧前运动皮层上的离线TMS减少了刺激区域的任务相关活动，并在运动网络的其他区域（包括对侧同源区域）诱导了代偿性上调。这显示了神经影像学和多焦点TMS的结合如何深入了解任务特异性神经网络的补偿动态性。 7.7 认知模型和计算神经刺激 为了映射刺激引起的对感兴趣的认知功能的变化，必须有一个有效的认知模型，可以转化为任务。例如，双路线模型（dual-route models）已被用于解释冲突任务中的刺激-反应兼容性效应。这些模型假设并行的决策路径，这些路径可以在行为上分离，并在响应激活过程的水平上收敛。这些过程的动态可以通过分布分析来捕获，该分布分析映射决策过程中的干扰效应。因此，认知模型有助于将抽象和复杂的结构分解为几个子组件，这些子组件可以通过特定任务进行操作。NIBS可以探测这些子组件之间的动力学以及不同大脑区域对这些过程的功能相关性。最近，认知模型得到了计算神经刺激方法的补充，该方法模拟了紧急网络动力学并将其与真实数据进行比较。例如，计算模型可以通过对先前试验的影响进行建模来捕获选择重复偏差，从而更准确地反映选择动态。由于人类倾向于在现实生活中重复最近的选择，因此对选择历史进行建模提供了对实验室外决策的有效估计。这些模型生成了关于NIBS诱导的网络动力学调制对行为测量的影响的预测。它们允许预测可以通过实验验证的神经刺激的大规模网络效应。
第五个成对因果（箭头5）是指认知功能（或其调节）对特定行为任务中表现的影响。感兴趣的认知功能需要由特定任务操作，以测量它如何受到给定NIBS协议的影响，并且该任务必须足够困难才能对NIBS引起的（通常非常小的）认知变化足够敏感。通常，几种认知功能的相互作用对于任务的完成是必要的，并且需要对比其他认知过程的影响并建立任务特异性。 8.1 行为建模方法的好处 为了弥合认知模型和行为结果测量之间的差距，分布分析可以提供对不同反应策略的洞察。相对于平均响应速度或任务准确性等综合测量的一个优势是，它们考虑了整个响应分布（即正确和不正确的响应），并且对实验动力学和响应策略的个体差异更敏感。它们有助于克服复合测量的统计敏感性差。这种分析有助于区分认知理论的子过程。这些模型对可能被忽视的轻微调整特别敏感，特别是在NIBS研究中，效应量相对较小。除了二元选择任务之外，顺序抽样模型还适用于更复杂的多项选择决策，这可能更好地匹配现实生活中的决策。 8.2 量化NIBS效应的综合措施（composite measures） 大多数NIBS研究依赖于从单个平均响应速度或准确性得出的综合测量，通常使用方差分析或t检验进行分析。然而，NIBS研究可以从混合模型中受益，允许对非线性个体特征进行建模，并在处理缺失数据时提供更大的灵活性。这种方法对于纵向NIBS设计特别有用，其中单个时间点的数据缺失可能导致参与者被排除在外。有时，运动反应也可以通过电生理方式进行评估，例如，在言语产生任务中刺激运动和运动前区域期间从面部肌肉记录的MEP。对于其他任务，心理测量功能或反应偏差可能是选择的衡量标准。无论使用哪种行为测量，NIBS协议都可能首先影响任务效率，导致响应延迟增加（或减少），因为响应速度是比任务准确性更敏感的性能指标。然而，有时，任务准确性会受到影响，而对任务效率没有任何影响。关于TMS诱导的干扰效应对两个过程中任何一个的潜在机制，干扰效应的严重程度可能取决于感知阈值。例如，强干扰可能会抑制低于感知阈值的视觉刺激，导致任务准确性降低，无法通过提高响应速度来补偿，并且接近感知阈值的弱视觉刺激可能首先受到影响。相比之下，与任务相关的活动的轻微调制可能会选择性地延迟响应速度，延迟的增加会阻止对任务准确性的影响。脉冲的时间和刺激频率可能对刺激方案的结果起着至关重要的作用。例如，在视觉辨别任务期间响应速度存在强烈延迟的情况下，任务准确性没有任何损害，这可以用10-Hz rTMS协议来解释，认为TMS可能会在每个100毫秒的脉冲间隔内短暂中断处理，但永远不会完全干扰识别的相关信息。据我们所知，没有研究系统地改变刺激频率来调查更高的频率是否会影响辨别速度和准确性。大多数研究假设TMS可能会影响任务速度和准确性，但尚不清楚这两个参数的调节是否依赖于不同的神经机制。认知和计算模型可能有助于先验地指定对两个结果参数的预期影响，因为认知功能的不同子过程的概念化有助于分离预期结果。
如图1B所示，通过影响所研究的核心因果对的双方，即结构——功能（或大脑——行为）关系，几个因素可能会混淆假设的因果链（红框）。一些因素与NIBS的应用有关，例如直接（蓝框）或通过外围感觉通路（绿框）意外地共同刺激非目标大脑区域。其他因素（黄框）并非来自NIBS应用，而是来自实验设置（例如，任务需求），参与者的倾向（例如，当前的大脑状态，认知能力，信念和期望），或两者的相互作用（例如，学习效果）。所有这些因素要么直接影响大脑活动和认知功能，要么通过调节它们对NIBS的反应。这些因素中的非系统性差异显示出相当大的个体内和/或个体间变异性，可能会损害NIBS协议调节目标认知功能（产生假阴性）的整体有效性，而实验条件的系统性差异可能会为参与者内部引入系统混淆（假阳性）。为了防止混淆，需要消除这些因素，在实验条件下保持恒定，或者明确包括实验对照条件。 9.1 非目标区域和网络的共同刺激 TMS和TCS的应用可能会产生副作用，从而产生箭头2的相关混杂，即非目标大脑区域的有效电场和周围神经元结构的共刺激。如果刺激强度足够大，TMS诱导的电场也将在相邻的非目标位置（蓝框）达到有效水平，特别是在更表面的位置。因此，不太可能专门刺激沟深处的坐标，从而将局灶性刺激限制在回冠上。对于TCS，与靶标相比，广泛的电场在相似或更高的强度下导致更延伸的脱靶刺激。尽管与具有大电极的经典双电极蒙太奇相比，具有小电极的多电极蒙太奇的电场更集中，但有效的电场不会受到目标大脑区域的边界的限制。此外，TMS和TCS也在颅外周诱导有效的电场（绿框），皮肤中的幅度不可避免地大于大脑中的电场。特别是，TCS诱导的电场通过高导电性皮肤组织分流，也延伸到视网膜中的周围神经元结构和前庭系统。除了电场本身，刺激的物理副作用，如TMS线圈产生的“咔嗒”声和机械振动，也会影响皮肤中的机械感受器，并通过空气传播和骨传导到达内耳。然后，外周感觉结构的激活会导致初级和次级感觉大脑区域的意外激活，最终也会影响高阶区域。因此，这两种途径（蓝色和绿色）最终都可以激活远程区域并影响非目标认知功能。因此，局部和远程网络效应都会混淆NIBS诱导的目标活动对目标认知功能的影响。例如，当靶向更高的皮质关联区域，如下顶叶皮层，它整合了来自几种模式的信息，其NIBS相关激活可能来自经颅或感觉刺激。复杂的特定领域认知功能通常涉及几个领域的一般过程，如注意力、工作记忆或执行功能，这些过程（或其他不感兴趣的认知功能）的感觉破坏可能会严重影响任务处理并调节响应速度或准确性。 9.2 参与者的信念和期望 NIBS研究的参与者对神经刺激的影响和潜在的副作用有一定的期望和信念。这些期望和信念可以以一种可能与实验的基本假设一致或不一致的方式影响他们的表现。参与者还可以对实验的时间结构和当前的刺激条件（真或假）产生期望和实际知识，以便他们可以预测和准备在线NIBS研究中的刺激试验，或者在离线NIBS协议后表现不同。 9.3 任务需求、学习效果和认知能力 许多认知功能随时间（例如，由于学习或疲劳）和参与者而异。不同的认知能力基线表现水平差异导致在NIBS认知研究中观察到巨大个体间差异。在视觉启动研究中，单脉冲TMS促进了低绩效者的行为反应，但延迟了高绩效者的反应速度，这些影响与任务难度相互作用，表明刺激、大脑状态和任务诱导状态之间存在复杂的相互作用。这种相互作用使从给定的NIBS协议得出的结论复杂化。此外，学习或泛化效应会影响表现，特别是如果在不同的刺激条件下重复测量相同的任务，就像通常在参与者内设计中所做的那样。这些效应的潜在影响需要通过平衡参与者的任务顺序和刺激条件来控制。在隐含任务或学习范式无法重复的情况下，需要采用参与者之间的设计。其他非特异性影响，如一天中的时间和荷尔蒙周期也可能影响认知功能。其中一些因素可以（并且应该）在实验条件下保持恒定，例如，通过在一天中的同一时间对同一参与者进行重复测量。 9.4 当前的大脑状态 NIBS效应的大小和方向也可能因参与者内部和参与者之间刺激时当前大脑状态的差异而有所不同。“状态依赖”的概念首先被引入视觉系统，状态依赖效应已经在各种（认知）领域进行了描述。在比较不同TMS强度对休息和抓握任务期间神经活动的影响时，同步TMS-fMRI也证明了远程网络节点的状态依赖性。关键的假设是大脑状态会影响受刺激神经元群体中兴奋性的分布，进而影响它们对刺激的反应。皮质兴奋性的这种振荡调节导致了脑状态依赖性脑刺激的想法，即将刺激限制在某个目标状态。大脑状态动力学也可能改变NIBS干扰效应，使得通常会损害感知的强度突然产生促进作用。当前的大脑状态也可能与TDCS研究中的极性相互作用，这对于涉及不同训练阶段的学习研究尤其重要。虽然最初是为在线TMS引入的，但状态依赖性也被建议影响离线NIBS协议。例如，10-Hz TACS对随后的EEG α功率的促进后效应仅在睁开眼睛但不闭眼的情况下应用TACS时才明显。此外，经典的离线NIBS方案在其后效应中显示出较大的个体内和个体间差异，这取决于个体内（例如，当前大脑状态、突触活动史、激素水平、昼夜节律）或个体之间（例如，性别、年龄、个体水平目标区域的深度和方向、遗传学）的差异，有时会导致无效结果。运动系统中对离线TMS协议的响应的个体变异性可能受到特定中间神经元网络的影响，皮质脊髓兴奋性测量可能有助于分离应答者和无应答者。然而，目前尚不清楚这如何转化为认知功能，因为M1的兴奋性与其他区域的反应性无关，并且认知能力和功能组织的个体间差异进一步导致响应NIBS协议时的巨大个体间变异性。 9.5 亚可塑性 离线刺激方案可能进一步受到亚可塑性的影响，使得突触可塑性本身可能根据神经元突触后活动的历史而变化。代谢可塑性有助于网络功能和行为，可能是稳态或非稳态的。稳态亚可塑性已在人类 M1 中被证明用于可塑性诱导 NIBS 协议的几种组合。例如，应用相同的启动和测试θ爆发协议可能会逆转测试协议的效果，而使用相反协议的启动被证明可以增加测试协议的效果。值得注意的是，由两个连续的NIBS协议诱导的亚可塑性的影响强烈依赖于启动和测试方案之间的时间，因为随后两个类似的θ爆发方案的组合也可能导致对皮质脊髓兴奋性的非稳态加和效应。这些发现与认知神经科学研究特别相关，因为许多训练干预与NIBS协议相结合以增强行为干预的效果，并且稳态代谢性原理可能在整个皮质区域推广。然而，对于大多数干预措施来说，任务和刺激之间的最佳时机仍然未知，并且通常忽略了亚可塑性的潜在影响。上述讨论的结果表明，代谢可塑性可能会增加，减少甚至逆转给定NIBS协议的预期方向。虽然目前还不清楚这如何影响认知过程，但这种影响可能会导致认知神经科学领域的NIBS研究的意外结果或无效发现。
在概述了可能中断或混淆典型认知神经科学NIBS研究的因果链的众多因素之后，我们现在讨论最重要的实验控制条件。控制条件用于控制在NIBS实验中无法完全消除的影响，例如非目标大脑区域或网络和周围感觉结构的无意共同刺激，参与者对NIBS程序的期望和信念的影响，以及任务表现对其他非目标认知功能的不可避免的依赖。重要的是，实验中包含的控制条件决定了可以从结果中得出的结论。NIBS实验的典型原理是，如果给定的NIBS协议，在相对于任务的某个时间点应用，影响行为表现，这证明了目标区域和/或神经元活动模式与任务认知功能的因果相关性。根据假设，对所研究的大脑行为关系在目标解剖位置、时间窗口和/或振荡频率方面的特异性以及任务的受影响方面做出了几个明确（或隐含）的假设。出于可行性原因，在单个研究中几乎不可能实现所有控制条件，尤其是在完全交叉因子设计中。但是，任何特异性声明都需要使用适当的控制条件进行明确测试。 10.1 无刺激条件 早期的研究通常包括没有刺激（即“无TMS”）作为对照条件的试验，有时随机交错有效刺激以控制残留（carry-over）和实践效果。然而，这并不能控制任何非特异性的副作用，TMS和没有TMS之间的差异对参与者来说是显而易见的。为了避免试验或条件之间的残留效应，可以设计试验间歇和/或TMS训练的持续时间，或者可以将类似条件的试验分组为短的组块（blocks）。 10.2 假TMS 假TMS旨在模仿感官共刺激，并作为安慰剂条件来控制参与者的信念和期望。已经采用了不同的假TMS方法，包括用垫片将线圈与头皮物理分离，在有源线圈顶部放置一个倾斜90°的额外线圈，并选择性地将前者关机作为假状态，稍微倾斜头皮上的线圈以避免刺激潜在的大脑区域。将线圈从头皮上移开可以保留线圈充电引起的空气传播声音，但很少或没有诱导骨传导，并且完全缺乏体感共刺激。同样，与有源TMS相比，顶部的额外线圈或倾斜线圈，使得只有边缘接触头部，产生大致相当的听觉输入，但由于缺乏周围神经刺激，几乎没有躯体感觉输入。传统的假线圈也是如此，它们通过屏蔽或逆流来降低有效刺激强度，这可能会阻止对目标区域的有效刺激，也会阻止对外围结构的有效刺激。因此，这些方法很难实现受试者盲法。这对于认知神经科学研究中经常使用的参与者内部设计尤其成问题。为了克服这些限制，“现实”假条件旨在模仿躯体感觉副作用。因此，最先进的逼真假条件结合了单独调整的听觉噪声，以减弱真和假条件下的点击声音，线圈下方的泡沫填充以衰减振动，并通过TMS线圈下方的表面电极单独调节皮肤电刺激以模仿周围神经刺激。然而，即使单独调整电刺激强度，有经验的参与者也可能注意到现实假刺激和有效刺激之间的差异，因为电刺激的皮肤感觉会有所不同。当在线TMS以更高的强度应用于刺激可能产生令人不快的副作用（如颅骨/面部肌肉抽搐）的区域时，这尤其成问题。这些副作用可以大大混淆获得的结果，如工作记忆表现与TMS不愉快的个人评级之间的负相关。因此，真刺激控制位点始终是可取的。然而，真刺激控制位点的选择可能很棘手，特别是如果研究广泛分布在整个大脑中的复杂认知功能，从而排除了使用最匹配的区域作为控制位点。 10.3 假TCS 与大多数TMS研究相比，TCS研究通常包括假刺激条件，但没有真刺激对照位点（即对照蒙太奇）。假TCS通常是通过将电流增加到目标强度来实现的，例如，10-30秒，然后立即再次下降，没有任何进一步的真刺激，从而在开始时产生一些皮肤的感觉（刺痛，瘙痒，灼热），据说使真实和虚假的TDCS无法区分。然而，最近的证据表明，即使使用大约 1 mA 的低刺激强度，参与者的盲法也会受到影响。最近推出的假 TCS 协议通过基于模型的经皮和经颅效应量化将多电极蒙太奇与受控电流分流相结合，确保在整个刺激过程中具有恒定的头皮感觉和相对于有效 TCS 的类似感觉。与传统的双焦点斜坡上升、斜坡下降假刺激方案相比，该方案在受试者盲法方面更胜一筹，并且可能为 TCS 提供现实的假刺激条件。至于TMS，仔细匹配的真刺激对照蒙太奇也是TCS研究的黄金标准。在TDCS研究中，可以通过对感兴趣的靶区应用阳极和阴极TDCS来额外测试极性特异性。 10.4 通过无效刺激方案进行控制对照 对于某些NIBS协议，可以创建无效的刺激方案，该方案可以应用于同一区域而不会引起关键的神经元效应。例如，训练间（intertrain）持续时间的变化使θ爆发刺激方案无效，并且用单个脉冲替换θ脉冲（triplets）也不产生后效应，因为5 Hz的200个脉冲可能没有持久影响。配对的联合刺激协议在参与者不知不觉中使用随机选择本身无效的ISI时变得无效。通常，剂量减少可以使方案无效，例如，通过降低刺激强度，脉冲数或应用的总持续时间。此外，TMS线圈方向的变化（通常相对于目标回从正交到平行）足以消除特定效应。除了简单的剂量减少，不可避免地改变感觉共刺激的量，并可能改变参与者对刺激有效性的信念，这些控制可以被认为是与有效实验方案相对匹配的高级控制条件，尽管它们伴随着残留经颅效应的风险。 10.5 控制对照任务（任务特异性） 任务特异性意味着，如果皮质区域X与认知过程A相关但与B无关，那么区域X上的给定NIBS协议应该选择性地调节任务A而不是B。这要求控制对照任务在感兴趣的认知功能上选择性地不同于感兴趣的任务，但在任务难度、低水平的感觉输入和支持性认知功能（例如，感知、注意、工作记忆、执行或运动需求）方面是匹配的。如果没有任务特异性的证据，NIBS协议可能会简单地干扰这些认知功能，从而可能对行为表现产生相同的影响。重要的是，某些任务（例如，视觉注意或定向任务）也可能受到感觉共刺激的更强烈影响。 10.6 控制对照区域（解剖特异性） 解剖学特异性意味着NIBS协议仅在应用于区域X时影响任务A，而区域Y时不影响，因为只有前者对感兴趣的认知功能有因果贡献。因此，需要一个有源TMS控制位点或TCS电极蒙太奇来证明观察到的效果实际上取决于特定大脑区域的刺激，而不仅仅是大脑本身或其感觉输入结构的刺激。许多研究使用顶点（vertex）作为主动控制位点，其基本原理是听觉和躯体感觉输入应与其他靶位点大致相似，但脑组织位于头皮下方更深处，被认为主要包含下半身的感觉运动表征，因此不会影响认知任务表现。然而，根据感兴趣的目标区域，偏侧化是一个潜在的问题。此外，使用同步TMS-fMRI证明应用于顶点的超阈值低频rTMS在默认模式网络中诱导了广泛的失活，尽管受刺激区域中的BOLD信号不受影响。尽管这些远程效果的来源尚不清楚，但这意味着顶点可能不是涉及默认模式网络或与默认模式网络交互的任务的合适控制位点。鉴于任务正性（task positive）网络和默认模式网络的复杂相互作用，这将排除对大多数认知功能使用顶点刺激，特别是那些与默认模式参与直接相关的功能，如语义处理，社会认知，自传记忆，自我相关思维和意识。对于某些区域，同源区域可能是足够的主动对照位点，特别是如果对特定认知功能的偏侧化感兴趣。然而，TMS也可能通过胼胝体连接影响对侧区域（参见箭头3），特别是如果使用高强度或高频。对于某些认知过程，偏侧化不太清楚，同源区域可能有助于给定的任务。选择与最重要维度相匹配的主动控制位点可以通过最近推出的TMS研究图谱进行指导。同样对于TCS，与外周共刺激效应匹配良好的对照蒙太奇应该是强制性的，至少要求一定程度的解剖特异性。对于离线NIBS方案，应间隔几天在不同的疗程中靶向不同的刺激位点，以防止刺激的任何残留效应。 10.7 控制时间点（时间特异性） 根据研究问题和应用的NIBS协议，时间特异性可能至关重要。事实上，计时方法极大地推进了当前关于不同认知过程的时间过程的知识，例如视觉感知、视觉方向和意识、运动驱动的注意力、声音定位、工作记忆或语言。大多数系统地改变刺激时间点的计时TMS研究认为不需要控制位点，因为特异性由时间点之间的差异显示。然而，这种假设是无效的，因为在刺激发作之前或刺激发作时立即给出的在线TMS充当警报信号，并对反应速度造成非特异性的跨感觉促进效应。如果TMS在某些试验中发生在刺激之后，则导致参与者“等待”TMS脉冲，反应速度可能会延迟。 10.8 控制频率（频率特异性） 在大多数NIBS研究中，频率特异性被忽略。然而，对于一些研究问题，这可能是至关重要的，特别是如果得出关于节律性NIBS协议的夹带或可塑性后效应的结论。例如，在一个假设的实验中，除了解剖学特异性（包括控制蒙太奇和假刺激作为基线）和任务特异性（包括匹配良好的控制任务）之外，pFC上的β-TACS影响工作记忆的结论只有在能够证明这些影响是频率特异性（包括控制频率）的情况下才有效。事实上，在使用TACS的认知神经科学研究中，频率特异性经常被考虑，但许多研究仍然只是简单地将感兴趣的频率与假刺激进行比较，这并不能证明任何关于刺激频率相关性的结论是合理的。一些研究明确使用了低于和高于目标频率的对称控制频率，以防止与刺激持续时间或周期数混淆。然而，还没有建立明确的程序来定义控制频率的数量或与感兴趣频率的距离。显然，控制频率不应该从事感兴趣的任务。刺激频率的个体调整可能是有利的，至少在α波段是有利的，尽管目前尚不清楚当刺激与大脑的特征频率相匹配时是否更有效或略有不同。值得注意的是，TACS可以在大多数频率下诱导节律性视网膜光幻和皮肤感觉，尽管具有不同的阈值，再次强调仅靠频率控制是不够的，需要采用控制蒙太奇。
为了保证整个实验中准确的线圈或电极放置和维护，并避免刺激装置运动引起的混杂，强烈建议使用立体定向神经导航系统和单个T1加权图像。一般来说，TCS研究受益于优化的蒙太奇或计算优化的多通道安排，这可能有助于聚焦受刺激区域并最大限度地减少不需要的外围共刺激。应采用电场建模来估计电极蒙太奇或线圈放置的焦点，最大限度地减少非皮质刺激的影响，并优化刺激效率。与认知神经科学领域的许多其他研究一样，NIBS研究经常遭受相对小和同质的样本（即，主要是健康的年轻学生志愿者，样本量<30名参与者），这不能代表一般人群。统计功效的先验计算可以指导样本量选择，我们主要提倡更大的样本量，但对于大多数NIBS研究，效应量是事先未知的。只要有可能，NIBS实验应作为参与者内部设计进行，以减少基于组成员不完全随机化的个体间变异性和混淆。如果在参与者间设计中实现了控制条件，则控制条件需要具有与实验条件相同的样本量，以排除混杂的统计功效。 设计有效NIBS研究的十二条一般建议： 总而言之，我们提出以下12个一般建议，在设计认知神经科学的NIBS研究时要考虑（这些建议的适用性可能因研究问题的具体情况以及实验室的技术/逻辑可行性而异）： [1]了解您的靶点！确保您以合适的NIBS技术空间精度确定了刺激靶点。如果可能，考虑使用基于fMRI的定位仪进行靶标识别。 [2]模拟电子场！使用基于真实MR头部模型的单个电场建模来证实电场在目标位点最大（灵敏度）并尽可能局限于靶位点（特异性）。 [3]调整刺激强度！考虑到线圈-皮层距离，刺激强度应单独调整，即使尚不存在理想的参考值（使用% RMT）。诱导电场强度的估计（尚）不是最先进的，但建议使用。 [4]使用神经导航！基于MR的单个神经导航可确保在session内和session间精确放置和维护TMS线圈/ TCS电极，并且是高质量TMS和高精度TCS研究的基本先决条件。 [5]将NIBS与神经成像相结合！使用神经影像学（例如，fMRI、EEG/MEG）来建立有效性证据或靶点激活，即证明在目标区域/网络中已经诱导了所需的神经元效应，并且其他区域/网络的意外共激活不会混淆结果。这也允许将NIBS诱导的神经元和行为效应联系起来。 [6]包括一个控制位点！真刺激控制部位（TMS）或蒙太奇（TCS）与感觉和不适感非常匹配，是感觉共刺激混淆的强控制，并有助于建立解剖特异性。作为基线的额外的（现实的）假刺激条件是最佳的。 [7]包括控制任务！适当的控制任务不涉及感兴趣的认知功能，但与任务难度相匹配，是通过共同受影响的认知功能（例如，注意力）对可能的混淆进行强有力的控制，并有助于建立任务特异性。 [8]包括控制时间窗口（如果适用）！如果目标神经元过程的时间很重要（例如，在进行心理计时时），则需要在不同时间点/窗口进行刺激以建立时间特异性。 [9]包括控制频率（如果适用）！如果要演示夹带或类似的频率特定效果，则必须使用相邻控制频率（理想情况下为较低和较高频率）。不规则（arrhythmic）控制刺激可以控制刺激脉冲/周期的数量和节律性的存在，但不能建立频率特异性。 [10]尽可能减少可变性！参与者内部设计减少了个体间的差异性，但是当重复刺激或任务表现由于盲法或学习效应的原因而出现问题时，参与者之间的设计是必要的。内部和外部背景因素（例如，一天中的时间、觉醒）应尽可能在条件之间保持可比性。 [11]防止残留（carry-over）和预定（order）效应！对于离线NIBS协议，控制条件需要在间隔几天的单独疗程中进行并平衡，以确保先前诱导的突触可塑性不能系统地与当前协议相互作用。 [12]明智地选择您的DV！彻底考虑最能反映认知功能预期变化的结果测量。单独滴定任务难度，使其性能对底层计算的微小干扰变得敏感。 总结： 本文概述了测试和解释认知神经科学中NIBS研究的因果链的主要挑战和潜在陷阱，并为设计有效的NIBS实验提供了指导。未来的一个研究方向是NIBS与计算建模和神经成像的多方法组合，以绘制神经元和网络水平的刺激诱导的变化，并将这些变化与认知和行为效应联系起来。为了加深我们对NIBS方案调节作用的理解，未来的研究应将目标区域中诱导电场的模拟强度与基于神经影像学的目标参与和行为结果测量评估联系起来。由于NIBS研究复杂且耗时，并且参与者的调节效应通常很小且变化很大，因此未来的一个特殊挑战是包含更大的样本量以保证足够的实验Power。在这里，多中心方法可以为NIBS研究确定有效的范式，这些范式可以提供对结构——功能因果关系的进一步见解。 |
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