美拉德反应研究进展及在食品工业中的应用

美拉德反应（Maillard reaction）也称为羰氨反应，是一种非酶褐变（Non-enzimic browning），本质上是羰氨间的缩合反应，主要指的是醛、酮、还原糖的羰基与氨基酸、肽、蛋白质等含氮化合物的游离氨基之间发生的一系列反应，此反应会产生许多美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs），如挥发性香气物质、高活性且有紫外吸收的中间产物和复杂的黑色高分子聚合物蛋白黑素[1-2]。

1912年，法国化学家L. C. Maillard对甘氨酸和葡萄糖混合共热的时候会形成褐色物质这一现象进行了报道。1953年，J. E. Hodge等[3]把这个反应正式命名为美拉德反应，因其最终产物主要是棕色的类黑素，亦被称为类黑素反应（Melanoidin Reaction）。此类反应常存在于食品加工、酒业酿造、中药炮制、烟草研制、疾病生理以及饲料制备等过程中。自20世纪50年代后，美拉德反应一直备受关注。60年代的研究集中在对其挥发性化合物的分离与鉴定。70年代和80年代初，美拉德反应的研究重点在于模拟反应系统、反应条件以及生成的风味化合物的分析研究。近年来，美拉德反应还在中药现代化和疾病生理等方面成为新的研究热点[4]。

1 反应机理、产物及影响因素

1.1 反应机理及产物[5]

美拉德反应机理迄今为止还未研究彻底，该反应过程和反应产物十分复杂，包括许多不同反应网络。Hodge所提出的网络系统分类图解是目前对美拉德反应公认为最经典的诠释。通常分为3个反应阶段及3条反应路线。3个阶段分别是初级阶段（Early Stage）、高级阶段（Advanced Stage）和终极阶段（Final Stage），目前对于前两个阶段的机理已经基本明确，但是终级阶段机理还不是很明确。

初级阶段，还原糖的羰基与含有自由氨基的化合物之间发生缩合反应，生成氮取代的糖基胺（希夫碱，Schiff Base），它不稳定，容易发生不可逆重排产生中间产物。对于醛糖，重排产生稳定的阿马多利产物（Amadori Products，ARP）；而对于酮糖，则是产生海因氏产物（Heyn’s Products，HNP）。初级反应产物不会引起食品色泽和香味的变化，但其产物是不挥发性香味物质的前体成分。

高级阶段，此阶段ARP有3种降解途径：（1）在pH≤7时，果糖基胺进行1, 2-烯醇化反应，再经过脱水、脱氨最后生成羟甲基糠醛。羟甲基糠醛的积累与褐变速度密切相关，羟甲基糠醛积累后不久就可发生褐变反应，因此可以用分光光度计测定羟甲基糠醛积累情况作为预测褐变速度的指标；（2）在pH＞7且温度较低时，果糖基胺进行2, 3-烯醇化反应，经过脱氨后生成还原酮类和二羰基化合物。还原酮类化学性质活泼，可进一步脱水再与胺类缩合，或者本身发生裂解，生成较小分子，如二乙酰、乙酸、丙酮醛等；（3）美拉德反应风味物质产生于此途径。在二羰基化合物的存在下，氨基酸发生脱羧、脱氨作用，成为少一个碳的醛，氨基转移到二羰基化合物上，这一反应为斯特勒克降解反应。此反应生成的羰氨类化合物经过缩合，生成吡嗪类物质。

终级阶段，蛋白黑素的形成，此阶段包括醇醛缩合、杂环化与醛氨聚合等多种反应，过程复杂，主要是由美拉德反应中的活性中间体继续与氨基酸反应形成的。

1.2 反应的影响因素[5]

1.2.1 糖

从发生美拉德反应速度上看，糖结构和种类的不同导致反应发生的速度也不同。一般而言，醛的反应速度要大于酮，尤其是α、β不饱和醛反应及α-双羰基化合物；五碳糖的反应速度大于六碳糖；单糖的反应速度要大于双糖；还原糖含量和褐变速度成正比关系。

1.2.2 氨基化合物

在常见的几种引起美拉德反应的氨基化合物中，发生反应速度的顺序为：胺＞氨基酸＞蛋白质。其中氨基酸常被用于发生美拉德反应，氨基酸的种类、结构的不同会导致反应速度有很大的差别，比如氨基酸中氨基在ε-位或末位这比α-位反应速度快，碱性氨基酸比酸性氨基酸反应速度快。

1.2.3 温度

温度相差10 ℃，褐变速度就可相差3～5倍。当温度＞30 ℃时，褐变速度较快；当温度＜20 ℃时，褐变速度较慢。

1.2.4 pH

pH在3～9范围内，随着pH上升，褐变反应速度上升；pH≤3，褐变反应程度较轻微。在偏酸性环境中，反应速率降低。因为在酸性条件下，N-葡萄糖胺容易被水解，而N-葡萄糖胺是美拉德特征风味形成的前体物质。

1.2.5 水分含量

10%～15%含水量，容易发生褐变；完全干燥情况下，褐变难以进行。

1.2.6 金属离子

铜与铁可促进褐变反应，其中三价铁的催化能力要大于二价铁。

1.2.7 亚硫酸盐

在美拉德反应初期阶段就加入亚硫酸盐可有效抑制褐变反应的发生。主要原因是亚硫酸盐可以和还原糖发生加成反应后，再与氨基化合物发生缩合，从而抑制了整个反应的进行。

在实际生产过程中，根据产品的需要，要对美拉德反应进行控制。基于以上因素我们可以总结出控制美拉德反应程度的措施：（1）除去一种反应物：可以用相应的酶类，比如葡萄糖转化酶，也可以加入钙盐使其与氨基酸结合成不溶性化合物；（2）降低反应温度或将pH调制偏酸性；（3）控制食品在低水分含量；（4）反应初期加入亚硫酸盐也可以有效控制褐变反应的发生。

2 研究内容与方法

目前关于美拉德反应的研究主要集中于其中间产物和终产物的分离分析，尤其是非挥发性产物。主要采用薄层层析色谱、超滤及液相色谱等方法进行分离，而采用紫外可见（UV-vis）、红外光谱（IR）、荧光光谱、液相-串联质谱（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR）等多种技术进行性质和结构的分析鉴定。

薄层层析色谱是快速分离和定性分析少量物质的一项重要实验技术，常用于MRPs的分离和半定性分析。Lee等[6]报道丙三醇可以诱导晶状体蛋白交联，并采用薄层层析色谱法鉴定出反应产物。

膜透析法是分离提纯MRPs的一种简便而有效的方法。采用膜透析法能有效地将体系中未反应的原料和小分子产物除去，从而可以得到大分子量MRPs。采用不同截留分子量的透析膜对大分子量MRPs进行透析，可以选择性地得到不同分子量的产物，这样能更准确地对其成分和结构进行分析。Kroh等[7]采用截留分子量为14 000～16 000的纤维素透析膜对MRPs进行透析后，分别对未透析的产物和透析后的产物进行HPLC分析，结果表明通过膜透析可以完全除去产物中的小分子，但是透析过程中大分子产物也会有所损失。

MRPs含量少且极不稳定，目前的研究主要集中于小分子量MRPs的分离分析研究，如低分子量色素及低分子量的MRPs的形成结构及机理研究。Chuyen等[8]采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术鉴定挥发性化合物，分析氨基酸的变化，并采用离子交换色谱、UV-vis、IR和NMR等技术分离鉴定二肽与乙二醛形成的MRPs，提出二肽与乙二醛的反应机制至少有两种：一种是肤键断裂释放氨基酸，进而与乙二醛通过Strecker降解反应生成醛类化合物；另一种可能的机制是，二肽与乙二醛形成中间产物，然后环化形成吡嗪酮。

Hatano等[9]通过XAD-7HP型大孔树脂、葡聚糖凝胶G-50色谱和凝胶渗透色谱（GPC）对甘蔗加工过程中由于美拉德反应形成的有色产物的分离，采用UV-vis、IR、元素分析、MS和动态光散射（DLS）分析技术鉴定了糖蜜色素的基本结构，且该类化合物具有较强的木瓜酶抑制活性。Dai等[10]在赖氨酸、组氨酸和D-苏糖低温美拉德反应体系中，采用LC-18SPE（固相萃取柱）初步纯化，再通过RP-HPLC技术分离3次，同时配备在线紫外检测器和荧光检测器，并采用在线收集器收集特定质荷比的组分，并利用一维、二维NMR技术并结合LC-MS/MS技术，鉴定出该有色物质是Histidino-threosidine。Hao等[11]采用HILIC硅胶柱色谱对美拉德反应混合体系中甘氨酸、二甘肽、三甘肽和其相应的Amadori产物N-（1-脱氧-D-葡萄糖-1-基）-甘氨酸、N-（1-脱氧-D-葡萄糖-1-基）-二甘肽和N-（1-脱氧-D-葡萄糖-1-基）-三甘肽进行分离，通过提高柱温以及调整流动相可获得较好的分离效果。Frolov等[12]以HFBA（Heptafluorobutyric acid）为离子对试剂，采用IP-HPLC技术对Amadori肽与未经糖修饰的肽组分进行有效地分离，该法既适合在线电喷雾质谱（ESI-MS）检测，又适合离线基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）检测，甚至适合于纳米级别的质子化研究。

对MRPs中大分子量产物研究主要集中于蛋白黑素[13-15]，其不仅影响食品的颜色，还可与食品中的风味物质相结合，影响食品的风味特征和感官品质。蛋白黑素结构复杂，分子量较大，其具体结构和形成机理仍不是很明确。Rufian-Henares等[16]用超滤及渗滤法对几种氨基酸-葡萄糖体系MRPs蛋白黑素进行了分离，对其体外的功能特性研究发现，结合到蛋白黑素上的低分子量化合物（BMC组分）抗氧化特性及抗菌特性通常高于纯的蛋白黑素聚合体，其降压特性与蛋白黑素核心成分有关，而与BMC组分无关。Smaniotto等[17]的研究发现，蛋白黑素是蛋白质和糖的热降解产物形成的，典型特征是在300～600 nm处有吸收带。一些研究常采用酸法或酶法水解蛋白黑素，分析产物的组成。Cammerer等[18]采用酸水解蛋白黑素，结果发现在无水条件下，糖类化合物主要以糖分子形式参与反应，水解后仍可以得到单糖分子，当体系含水量增加时，糖类化合物首先发生醇醛缩合反应，产生的糖片断再参与美拉德反应，蛋白黑素水解后得到较少的糖分子。

另外，同位素示踪法也是MRPs分析手段中有效的常用辅助分析技术，来跟踪MRPs结构中碳原子和氮原子的母体来源，有助于探索产物的形成途径和形成机理。Cerny等[19]研究了在丙三醇/水体系中果糖和丙氨酸在美拉德反应中的作用：随着反应体系水分活度的提高褐变会降低，同时通过同位素标记法发现丙三醇在这一体系中不仅是溶剂，还作为反应物参与反应，形成部分2-甲基吡嗪和2-乙基-3-甲基吡嗪等风味物质。Wang[21]还采用同位素[135C]-木糖跟踪挥发性化合物中碳的来源，以阐释母体化合物木糖及硫胺素对2-甲基-3-硫基吠喃及其它含硫化合物形成的贡献。结果显示，在半胱氨酸存在时，木糖和硫胺素均对2-甲基-3-呋喃硫醇和3-硫基-2-戊酮的形成具有重要贡献，而在没有半胱氨酸存在时，该两种含硫化合物均来源于硫胺素。Wang等[21]用同位素示踪法结合GC-MS分析来比较核糖和葡萄糖形成2-己酰呋喃的反应活性及路径，根据同位素异构物的比率可观察糖的反应活性，在形成2-己酰呋喃方面，核糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖及蔗糖的反应活性依次下降。在形成2-己酰呋喃时，各种糖产生的活性差异主要由于其形成的路径不同，如葡萄糖是通过完整的碳骨架环化直接形成，而核糖则先经过降解成糖片断再生成一个六碳单元后形成的。Davidek[22]用同位素示踪法研究木糖-甘氨酸美拉德反应体系中乙酸的形成路径，结果发现乙酸主要由木糖中C1和C2转化而来，其它较少部分来源于C4和C5，其中木糖中C1为活性碳原子。

3 食品工业中应用研究

3.1 美拉德反应与食品色泽

美拉德反应会赋予食品一定的深色，比如面包、咖啡、红茶、啤酒、糕点和酱油等，对于这些食品颜色的产生都是我们所期望的。但有时美拉德反应的发生又是我们不期望的，比如乳品加工过程中，如果杀菌温度控制得不好，乳中的乳糖和酪蛋白发生美拉德反应会使乳呈现褐色，影响了乳品的品质。美拉德反应产生的颜色对于食品而言，深浅一定要控制好，比如酱油的生产过程中应控制好加工温度，防止颜色过深。面包表皮的金黄色的控制，在和面过程中要控制好还原糖和氨基酸的添加量及焙烤温度，防止最后反应过度生成焦黑色。

3.2 美拉德反应与食品风味

通过控制原材料、温度及加工方法，可制备各种不同风味、香味的物质，比如核糖分别与半胱氨酸及谷胱甘肽反应后会分别产生烤猪肉香味和烤牛肉香味。相同的反应物在不同的温度下反应后，产生的风味也不一样，比如葡萄糖和缬氨酸分别在100 ℃～150℃及180 ℃温度条件下反应，会分别产生烤面包香味和巧克力香味[23]；木糖和酵母水解蛋白在90 ℃及160℃反应会分别产生饼干香味和酱肉香味。加工方法不同，同种食物产生的香气也不同，比如：土豆经水煮可产生125种香气，而经烘烤可产生250种香气；大麦经水煮可产生75种香气，经烘烤可产生150种香气。因此美拉德反应可用于咸味香精和一些调味品基料的生产。主要是采用还原糖和食品级的氮源如氨基酸、肽、蛋白质、植物水解蛋白及酵母提取物的等多种物质混合加热制备咸味香精，其中包括生物技术、脂肪氧化技术、烹饪技术、美拉德反应技术和调香技术等多种技术复合。另外，也可直接将美拉德反应物与一些物质复合，调配成特征风味的咸味香精，如将猪肉MRPs与猪肉香基、猪肉精粉、酵母精、糖、I+G等复配制备粉末状猪肉香精。通过美拉德反应可生产肉类、家禽类和海鲜类等多种风味类型的香精，美拉德反应生产的香精香气饱满、醇厚味浓郁及仿真度较高。目前，这些咸味香精已广泛应用于速冻食品、罐藏食品、方便面、香肠和咸味体闲食品等多种食品的加工及调味。美拉德反应对于酱香型白酒的风味贡献也很大，其中风味物质主要包括呋喃酮、吡喃酮、吡咯、噻吩、吡啶、吡嗪、吡咯等含氧、氮、硫的杂环化合物[24]。

美拉德反应的另一重要的应用是基于MRPs较强的抗氧化能力，产物通常作为天然抗氧化剂用于许多食品的加工中。美拉德反应的抗氧化活性是由Franzke和Iwainsky于1954年首次发现的，他们对加入甘氨酸-葡萄糖反应产物的人造奶油的氧化稳定性进行了相关报道[25]，但直到20世纪80年代才得到重视，成为研究热点。Lingenert[26-27]研究发现，组氨酸-葡萄糖的MRPs在饼干的焙烤中表现了较强的抗氧化性，同时还发现该产物可有效抑制香肠在冻藏过程中产生油脂氧化，防止腐臭味的产生。Augustin等[28]研究发现，蛋白质与糖经美拉德反应交联后，所得到的交联物具有较强的乳化性和抗氧化活性，并且在一个较宽的pH范围内稳定，可作为微胶囊化壁材用于微胶囊化鱼油粉的制备。一些研究发现[29-31]，氨基酸如精氨酸、组氨酸和半胱氨酸等的具有不同程度的抑制多酚氧化酶的活性，部分氨基酸的已用于苹果和香蕉等水果的褐变抑制。

3.3 美拉德反应与食品营养

美拉德反应可能引起一些不必要的食品营养价值下降。主要包括：①氨基酸的损失：美拉德反应消耗的主要是食品原料中的氨基酸和糖类。氨基酸因形成色素复合物和在Strecker降解中的破坏而遭受损失，且色素复合物在消化道内不能水解，降低了蛋白质的生物学效价[32]。实验表明，最易在褐变反应中损失的是人体必需氨基酸，如赖氨酸，从而降低了食品的营养价值。②矿物质的生物有效性下降：研究发现一旦美拉德反应发生，食品中矿物质元素有效性也有所下降，这可能是金属元素与MRPs生成金属络合物所致[33]。

4 结语

美拉德反应对于食品的色、香、味等风味特征的形成具有十分重要的作用。在食品工业中，对于美拉德反应的合理应用，不仅可以提高食品的感官质量，还可以丰富食品种类，研发出更多的新品种。目前，对MRPs中的小分子化合物的研究已经取得一定进展，但是对中间体和最终产物形成机理及结构和性质尚不清楚。因此，如何定量、定性地确定中间产物和终产物类黑精物质的组成、分子结构及其抗氧化机制等方面仍还需要进行更深入地研究；并且由于此反应过程及其复杂，产物众多，受外界因素影响太多，有些产物对人体具有一些致癌、致突变，心血管和肾脏损害等毒害作用，比如丙烯酰胺、呋喃和5-羟甲基糠醛等，研究清楚这些MRPs的具体形成机理和生成条件，以便有目的地控制特定产物的生成，达到在食品加工过程中促进有益产物的生成而抑制有害产物的生成，将成为该领域研究的重点。参考文献：略