【原】单细胞转录组揭示了胰腺癌肿瘤的中性粒细胞可被BHLHE40转录因子驱动

文章信息

题目：Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment
日期：2022-06
期刊：Gut
DOI：http://dx./10.1136/gutjnl-2021-326070

摘要

胰腺癌主要由胰腺导管腺癌 (PDAC) 组成，与其他实体瘤相似，PDAC 的特点是免疫抑制细胞在肿瘤微环境中广泛浸润。而肿瘤相关中性粒细胞 (TAN) 的浸润已被认为是大多数实体恶性肿瘤的不利预后因素。之前对来自 TCGA 队列的分析表明，与其他癌症类型相比，PDAC 中的 TAN 浸润相对丰富，这意味着 TAN 在 PDAC 微环境中的重要性。

本文使用 BD Rhapsody 从 5 名 PDAC 患者中获得了 21 972 个中性粒细胞的单细胞转录组，探索了 PDAC 微环境中 TAN 的异质性。

实验流程

取2名健康对照组（HC）、2名慢性胰腺炎患者（CP）、5名PDAC患者外周血CD66b+外周血多形核白细胞（PMNs）和肿瘤组织中捕获浸润性中性粒细胞进行单细胞转录组测序。

• 验证队列1：24个PDAC患者外周血和肿瘤组织中收集成对的CD66+细胞进行转录组、蛋白质组、代谢组检测，用于验证单细胞数据分析的结论
• 验证队列2：另外招募114例患者进行IHC、IF、空间转录组研究。

中性粒细胞的单细胞图谱

从来自外周血的33891个细胞和PDAC肿瘤组织的17932个细胞中，总共得到96692883个转录本，降维聚类分群得到了9群：中性粒细胞（占了两个clusters）、巨噬细胞、肥大细胞、B细胞、浆细胞、T细胞、导管细胞和成纤维细胞。其中中性粒细胞1在外周血中高度富集，而中性粒细胞2仅存在于肿瘤组织中。

继续探索肿瘤微环境中，中性粒细胞和其它免疫细胞间的相互作用。细胞通讯分析，发现PDAC组织肿瘤微环境中，中性粒细胞与巨噬细胞之间存在密切的相互作用，依赖于CCL13-CCR1、CCL3-CCR1、CCL3L3-CCR1等途径。GSEA富集分析表明，TNFα/核因子kB（NF-kB）和IL-1信号通路显著富集。

来自 PDAC 肿瘤的 TAN 的异质性

PDAC患者的PMN和TANs单细胞数据继续细分，发现PMN细胞，TANs细胞可再分为6个细胞亚群。亚群相关性分析指示，TAN细胞亚群间存在很大的差异性，说明肿瘤浸润性中性粒细胞具有异质性。

拟时序分析发现，中性粒细胞分化轨迹是以PMN为起点，历经过渡期的中性粒细胞亚群（TAN-3）进入到TAN状态，随后进入到TAN-0和高表达干扰素刺激基因细胞亚群（TAN-4）的中间肿瘤浸润状态，最后到达炎症相关亚群（TAN-2）和促癌亚群（TAN-1）的终极分化状态。

整个过程中，1757个基因的表达存在显著变化，主要集中于：

• 随着分化轨迹持续下调表达的基因，该类基因主要与IFN信号通路和先天免疫功能相关
• 在肿瘤浸润早期上调表达，主要参与吞噬和抗原呈递过程
• 在肿瘤微环境晚期被激活，主要在缺氧、内质网应激、IL-1和TNF信号通路及糖酵解途径中富集

代谢分析发现TAN的糖酵解途径被激活

相比于其他中性粒细胞TAN亚簇，TAN-1的糖酵解和缺氧活性显著升高，并沿着中性粒细胞分化轨迹逐渐上调表达。利用TAN-1 marker基因LGALS3识别到TAN-1中性粒细胞，其中葡萄糖转运体GLUT1、糖酵解酶HK2、PFKFB3、LDHA上调表达。代谢组数据显示，相比于PMNs，糖酵解通路中的糖类代谢物在TANs中显著增加。

发现关键调控因子BHLHE40

利用SCENIC分析，发现TAN-1标记基因之一BHLHE40是TAN-1中最显著上调表达的转录因子之一。根据SCENIC的基因调控网络，推测出BHLHE40是转录因子HIF1A和XBP1的下游靶基因，BHLHE40可调节TAN-1标记基因VEGFA、PLAU、 LGALS3、LDHA、BHLHE40 （自调控），以及TAN-2标记基因PDE4B、IL1RN的表达，表明由缺氧和 ER 应激诱导的 BHLHE40 促进肿瘤微环境中嗜中性粒细胞向促肿瘤表型分化。