在胰腺导管腺癌治疗中，靶向CXCR2 中性粒细胞和CCR2 巨噬细胞的疗法可以干扰其骨髓募集并改善其...

作者：王巧芳

摘要

目的：应用胰腺导管腺癌(PDAC)辅助趋化因子通路，促进骨髓中髓细胞募集，建立免疫抑制肿瘤微环境(TME)。单独靶向肿瘤相关的CXCR2+中性粒细胞(TAN)或CCR2+巨噬细胞(TAM)提高临床前模型的抗肿瘤免疫。然而，替代骨髓亚群的代偿性内流可能导致持久的免疫抑制TME并促进治疗耐药性。在这里，作者展示了CCR2和CXCR2联合阻滞剂可减少浸润肿瘤的骨髓样细胞的总量，促进了PDAC中抗肿瘤免疫反应的增强。

方法：对PDAC患者和对照组的外周血、骨髓和肿瘤进行分析。治疗反应和相关研究分别在小鼠原位PDAC肿瘤中使用小分子CCR2抑制剂(CCR2i)和CXCR2抑制剂(CXCR2i)单独和联合化疗。

结果：全身CXCR2+ TAN增加与PDAC预后不良相关，CCR2i患者治疗后肿瘤浸润CXCR2+ TAN增加。在原位PDAC模型中，CXCR2阻断阻止了中性粒细胞的流动和增强化疗疗效。然而，CXCR2+ TAN或CCR2+ TAM的缺失导致了替代骨髓亚群的代偿性反应，再现了人类疾病。通过联合使用CCR2i和CXCR2i，可以增强抗肿瘤免疫和改善对FOLFIRINOX化疗的反应。

结论：CCR2+ TAM和CXCR2+ TAN双靶向治疗可提高PDAC的抗肿瘤免疫和化疗反应。

背景
胰腺导管腺癌(PDAC)是导致癌症相关死亡的第四大主要原因，预计在未来十年发病率将会上升。尽管在PDAC中使用常规化疗取得了进展，5年生存率仍然是令人沮丧的8%，免疫抑制肿瘤微环境(TME)仍然是有效治疗的重要障碍。纤维化间质室被肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤相关中性粒细胞(TAN)浸润，这些细胞从骨髓中招募而来，以促进PDAC免疫逃避。因此，阻断髓系运输的治疗是恢复抗肿瘤免疫的一种有吸引力的方式。

中性粒细胞是最丰富的骨髓人群，有报道称在癌症中出现全身性粒细胞增加，与不良预后相关的是肿瘤内积聚的TAN (CD11b+、CD14、CD15+和CD66b+)。ELR+趋化因子家族中的CXCR2及其配体，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7和CXCL8，负责在正常生理条件下招募中性粒细胞，并参与肿瘤介导的TAN动员。携带肿瘤的动物也显示出全身性的TAN增加(CD11b+， Gr1High, Ly6CLow和LY6GHigh)，并且在临床前研究中，靶向TAN可以增加肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并改善对检测点阻断的反应。

作者先前的研究发现PDAC表达CCL2动员CCR2 +炎症巨噬细胞从骨髓肿迁移到肿瘤。然而，他们成为免疫抑制TAM。在多种恶性肿瘤中，密集的TAM(CD11b + CD115 +,CD14 + CD15和CD68 +)浸润与降低的生存率相关，且在小鼠肿瘤模型中，靶向CCR2 + TAM(CD11b + Gr1Low、LY6Glow Ly6CMid和F4/80High)治疗可减缓肿瘤进展。基于这些发现，作者使用口服小分子CCR2抑制剂(CCR2i) PF-04136309联合FOLFIRINOX对非转移性PDAC患者进行了临床试验(NCT01413022) ，与单纯化疗比较临床反应较好。

然而，肿瘤介导的骨髓来源细胞的招募是一个复杂的过程，而免疫调节疗法的破坏并非没有补偿性反应。一些研究发现，耗尽TAM导致了一种代偿性的TAN流入，这可能导致CCR2阻断后的治疗失败。因此，目前尚不清楚是否扰乱单个骨髓亚群是靶向免疫抑制TME的最有效方法。

在这里，作者报道了靶向CCR2+ TAM治疗的结果是PDAC患者的中性粒细胞补偿性流入，提供了第一个报告的证据，免疫调节疗法可能导致原发性肿瘤的动态髓样反应，可能限制预期的治疗效果。这种现象在有肿瘤的动物身上得到了再现，CXCR2+ TAN和CCR2+ TAM的协同靶向抑制了髓细胞的代偿性流入，同时有证据表明抗肿瘤免疫反应更强。这些数据建立在以人类癌症中骨髓来源细胞为靶点的新疗法的基础上，并表明以TAM和TAN为靶点可能是最佳的治疗组合。

本研究的主要内容

临床实验
1. PDAC患者外周血和骨髓中CXCR2+中性粒细胞全身性升高与总体生存期有关
2. 评估人PDAC中ELR+趋化因子表达升高与CXCR2+TAN和预后不良的相关性
动物实验
3. 在携带PDAC肿瘤的动物中，靶向CXCR2可以阻断外周血的中性粒细胞和阻断TAN募集 
4. 人类和小鼠的PDAC肿瘤显示骨髓细胞靶向治疗后发生了髓样替代，这可通过CCR2和CXCR2联合阻断来克服。
5. 联合减少PDAC浸润的CCR2+巨噬细胞和CXCR2+中性粒细胞，可以改善抗肿瘤T细胞的反应

内容1、PDAC患者外周血和骨髓中CXCR2+中性粒细胞全身性升高与总体生存期降低

首先作者用标准ROC曲线分析术前NLR（中性粒细胞与淋巴细胞比值）与术后患者生存率关系，最佳NLR截止时间为2.1，患者(n=439)分为高(>2.1)和低(2.1)两组。总体而言，PDAC患者切除后，高NLR (n=286)患者预后较差，5年生存率为17.3%，而低NLR组(n=153)生存率为26.5%。NLR高的患者中位生存期为18个月，而NLR低的患者中位生存期为23个月(HR=0.74 (95% CI 0.58 ~ 0.93))。

其次通过流式分析显示PDAC患者，外周血和骨髓中表达CXCR2的中性粒细胞均升高

然后通过与健康对照组相比，表明PDAC患者外周血中CXCR2+中性粒细胞明显增加，存活不足1年的患者外周血CXCR2+中性粒细胞较多，与生存率成反比。(P=0.019; Pearson’s = 0.66 (95% CI 0.90 - 0.14))

同样的，与对照组相比，PDAC患者骨髓中CXCR2+中性粒细胞增加。与外周血相似，这种增加与1年生存率降低有关，骨髓CXCR2+中性粒细胞百分比与生存率成反比
这说明PDAC导致外周血和骨髓中CXCR2+中性粒细胞全身性升高，与较差的临床预后相关。

内容2：评估人PDAC中ELR+趋化因子表达升高与CXCR2+TAN和预后不良的相关性

补充一下：趋化因子  CC和CXC是趋化因子其中的两个亚家族，CCR和CXCR是趋化因子的受体，CCL和CXCL是其对应的配体（即趋化因子）。CXC亚家族根据其第一个半胱氨酸前是否有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（Glu-Leu-Aeg)序列进一步分为ELR+和ELR-两类。前者有促进血管新生的作用。

首先表明趋化因子表达增加
作者采用QRT-PCR发现相对于正常人胰腺，PDAC患者肿瘤中ELR+趋化因子的表达增加与肿瘤浸润CXCR2+ TAN的增多程度相关，这与之前的报道一致，GM-CSF和G-CSF过表达，而M-CSF未见过表达。
作者又采用QRT-PCR对PDAC患者肿瘤组织进行分析，发现ELR+趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8表达增加，且可见CXCL5倍增最多。

其次表明趋化因子来源于肿瘤导管细胞
对PDAC患者肿瘤组织进行免疫荧光染色，发现肿瘤导管细胞是CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8的主要来源，而不是基质细胞。

然后表明CXCL5与CXCR2+TAN的相关性
作者特别关注CXCL5，因为它在ELR+趋化因子中表现出最大倍数增加，并发现CXCL5的表达与肿瘤浸润CD15+粒细胞(Pearson rho=0.837 (95% CI 0.73 - 0.90)呈正相关;图2D)和中性粒细胞弹性酶阳性(NE+)粒细胞(Pearson rho=0.635 (95% CI 0.43 - 0.70);图2 e)正相关。
总之，这表明PDAC表达的ELR+趋化因子，特别是CXCL5，可能对促进CXCR2+中性粒细胞的募集很重要。

再然后，表明肿瘤组织高表达CXCR2+TAN
作者通过免荧光显示PDAC肿瘤被CXCR2+ TAN严重浸润，通过流式细胞分析正常胰腺组织和肿瘤组织，显示肿瘤组织中CXCR2+TAN增多。PDAC被CXCR2+ TAN严重浸润，在人类疾病中具有预后意义。 

最后：表明ELR+趋化因子与预后的相关性
与NLR在外周血预后的发现类似，作者发现低、中、高CD15+ TAN + 与CD8+淋巴细胞比率在PDAC肿瘤中，中位生存率分别为2,1.5和1年(图2G)。与两组相比，高比率与整体存活率更低有关。此外，与其中任何一组相比，NE 与 CD8比值高的PDAC患者生存率降低与作者发现CXCL5表达与TAN浸润相关一致，CXCL5与CD8+比值升高也与预后较差相关，中位生存期为0.65年，与1.3年或1.8年相比分别在中、低两组观察到(图2I)。综上所述，提示CXCR2+ TAN是一种优势免疫浸润物，在PDAC中具有临床意义。

然后作者进行动物实验验证和靶向治疗

内容3：在携带PDAC肿瘤的动物中，靶向CXCR2可以阻断外周血的中性粒细胞和阻断TAN募集

首先构建动物模型
作者用鼠PDAC细胞系KCKO构建鼠原位PDAC肿瘤模型，采用QRT-PCR分析肿瘤组织中趋化因子表达情况。发现胰腺癌相对于正常胰腺表达GM-CSF、G-CSF和CXCR2的配体CXCL1、CXCL2和CXCL5增加。与人PDAC结果一致。

其次发现CXCR2+TAN升高
作者在上述构建的小鼠模型中通过对组织的流式分析发现，外周血和骨髓中CXCR2+中性粒细胞呈均升高，且这种升高不能被CXCR2i抑制，甚至在外周血中还具有促进作用。

然后发现CXCR2i可以抑制LY6G+细胞浸润
在上述动物模型肿瘤组织中,采用免疫组化方法发现，原发性肿瘤的特征是大量的多核LY6G+细胞浸润，且这种浸润可以被CXCR2i抑制.

再然后 CXCR2i靶向治疗对肿瘤体积的影响
用CXCR2i对上述构建的鼠模型进行靶向治疗，发现靶向治疗可显著降低皮下KCKO肿瘤进展。

为了证实这些发现，作者检测了来自KPC基因工程模型的另一个同源PDAC细胞系的原位肿瘤(p48CRE/LSL-KrasG12D/p53flox/flox)，发现CXCR2i也阻止了模型中TAN的积累(在线补充图S3)

最后表明CXCR2i或LY6G耗竭对肿瘤重量的作用
在建立的KPC疾病模型中， 作者用CXCR2i或LY6G特异性耗尽抗体治疗，发现与对照组相比，肿瘤重量减轻。综上所述，这表明CXCR2的阻断可以防止中性粒细胞从外周血中运输，减少TAN，其治疗效果与全身性耗竭相似

内容4：人类和小鼠的PDAC肿瘤显示骨髓细胞靶向治疗后发生了髓样替代，这可通过CCR2和CXCR2联合阻断来克服。

有研究已经在肿瘤组织中发现CCR2+中性粒细胞替代亚群，对PDAC边缘可切除局部高级别的患者进行靶向CCR2治疗临床实验，显示出可喜的结果。

因此，作者通过CCR2i阻断治疗4周后，对肿瘤组织活检，流式分析，发现靶向治疗后，肿瘤组织中CXCR2+TAN较基线水平升高。

然后表明骨髓靶向治疗的髓样替代作用
作者在荷瘤的CCR2-/-鼠和荷瘤的CCR2i处理的野生鼠中，25天后对肿瘤组织行流式发现CXCR2+TAM代偿性替代，这一现象也发生在联合FOLFIRINOX化疗中（图B,C）。单独靶向CCR治疗，TAM升高；单独靶向TAM治疗，TAN升高；两者同时抑制，TAN和TAM均降低，且在联合FOLFIRINOX化疗中效果一致（图C,D）。

这一现象的一种可能解释是观察到与TAM的产生和招募相关的因素，即CSF1和CCL2，在阻断CXCR2+ TAN后有所增加。同样，CCR2i导致CXCL1、CXCL2、CXLC5和G-CSF表达增加(在线补充图S4)。

随之作者通过流式分析评估总肿瘤浸润骨髓情况

发现联合CCR2i + CXCR2i抑制治疗，或者单独CCR2i或者 CXCR2i 联合FOLFIRINOX治疗，都能防止这种代偿作用并减少肿瘤浸润骨髓细胞。

然后作者在构建的荷瘤鼠模型中，分别进行抑制实验

发现CCR2 + CXCR2联合阻滞剂可提高肿瘤小鼠的化疗疗效并提高生存率，而CCR2i和CXCR2i作为单一药物有效降低了既定的原位肿瘤重量和体积。即使用双CCR2 + CXCR2阻滞剂可显著降低KCKO肿瘤，联合FOLFIRINOX化疗方案可以增加肿瘤对化疗的敏感性。

最后表明FOLFIRINOX联合髓样抑制对生存期的影响

当髓样阻滞与FOLFIRINOX联合使用时，肿瘤负担的减轻会增强。
FOLFIRINOX联合CCR2i或CXCR2i进一步提高了KPC基因工程模型的原位肿瘤小鼠的存活率(图4G)。

此外，与任何一种联合相比，FOLFIRINOX双重CCR2 + CXCR2阻断对提高生存率最多。

总的来说，这表明，与单独使用的两种策略相比，同时使用CCR2和CXCR2靶向骨髓细胞募集可以提高化疗反应敏感性。

内容5：联合减少PDAC浸润的CCR2+巨噬细胞和CXCR2+中性粒细胞，可以改善抗肿瘤T细胞的反应

首先作者在构建的肿瘤小鼠模型中说明靶向治疗对CD8+和CD4+ TIL的影响

通过靶向抑制CCR2或者CXCR2 25天后，对肿瘤组织行流式分析，发现肿瘤浸润髓样的减少却增加了小鼠的效应T细胞的量，联合抑制与单独抑制相比CD8+和CD4+ TIL的流入明显更大，当与FOLFIRINOX联合测试时也发现了这一点(图5A,B)。
我觉得B图纵轴应该是CD4+？，可能是标记错误。

然后表明靶向治疗后对CD4+亚群的影响

在原为移植肿瘤小鼠中，治疗25天后，流式分析，肿瘤组织中CD4+TIL细胞百分数，表明CCR2i或CXCR2i单独抑制时CD4+TIL细胞百分比明显减低，联合抑制时，没有更进一步的变化，在联合FOLFIRINOX治疗时出现一致的结果。

接下来,作者评估IFNγ+CD8 +TIL及激活状态的C8+细胞在靶向治疗后变化
荷瘤小鼠不同靶向处理25天后，肿瘤组织流式分析显示增加细胞内IFNγ，CD8 +TIL细胞表面表达的CD44 + 、CD69 +、CD62L标记物增加 。且联合靶向治疗后增加更多，尤其是激活状态的CD8+TIL细胞。

然后为了证实这种激活状态CD8+TIL的增加忠实地反映了T细胞受体(TCR)对抗原的识别，作者接下来检测了Nur77GFP小鼠从PDAC肿瘤中提取的CD8+淋巴细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达，该表达在TC R（T细胞抗原受体）刺激下上调。这表明，在双CCR2i + CXCR2i治疗后， CD8+TIL表达GFP增加。

总的来说，这些结果表明肿瘤浸润髓细胞的减少和效应因子的流入，靶向双趋化因子受体抑制可能是增强PDAC化疗反应的理想治疗策略。

接下来作者在已建立的原位移植PDAC肿瘤中，比较靶向治疗对肿瘤的抑制情况

与对照组相比，CCR2i或CXCR2单独靶向治疗，肿瘤抑制率高，恢复了抗肿瘤免疫作用。然而，同时靶向CCR2+ TAM和CXCR2+ TAN进一步增加肿瘤抑制率，进一步增强抗肿瘤免疫，当与FOLFIRINOX联合使用时效果更好。

然后作者对KCKO肿瘤鼠，联合趋化因子阻断与FOLFIRINOX 化疗治疗后25天，检测基因表达情况

发现，联合治疗后免疫抑制基因的表达减少与抗肿瘤免疫和细胞溶解性T细胞反应相关的因素的增加相对应。

最后，正如作者的结果所示，髓系阻滞后的抗肿瘤活性是通过适应性免疫机制介导的，作者进行了CD8耗竭实验 用IgG 做对照，结果表明，在缺乏CD8+淋巴细胞的情况下，髓系阻滞的治疗效果消失了。

综上所述，这些数据强调了骨髓来源的髓细胞在介导PDAC免疫逃避中的重要性，并为同时靶向CCR2+ TAM和CXCR2+ TAN提供了临床依据。

本研究的意义
在这个问题上已经知道了什么？
· 骨髓源性髓细胞, 包括肿瘤相关的嗜中性细胞 (TAN) 和肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 是由胰腺腺癌 (PDAC) 招募, 并促进免疫规避。
· PDAC 生产 CCL2 促进 CCR2+ 单核细胞外流从骨髓到肿瘤微环境, 在那里他们成为免疫抑制 TAM。
· 用小分子 CCR2 抑制剂联合 FOLFIRINOX治疗, 可防止 TAM 堆积,  PDAC 与单独化疗相比并表现出良好的治疗反应率。
· ELR+/CXCR2 趋化因子轴被牵连到 PDAC 介导的招募TAN, CXCR2 阻断在临床前肿瘤研究中表现出了希望。

新发现是什么？
· 在 PDAC 患者中，CCR2 抑制剂治疗导致 CXCR2+TAN 的代偿性涌入，。
· 系统性增加CXCR2+中性粒细胞与 PDAC 预后较差有关。
· 原位 PDAC 模型中，CXCR2 阻断, 单独或结合 FOLFIRINOX 化疗, 防止TAN从外周血的动员和增加效应瘤-浸润 T 细胞。
· 在一个原位 PDAC 模型中，重复髓样替代，并结合 CCR2 加 CXCR2 阻断减少总肿瘤浸润髓细胞, 与单独治疗相比增强抗肿瘤免疫和化疗反应。

在可预见的将来, 它将如何影响临床实践？
对PDAC患者， 联合靶向主要肿瘤-浸润髓样谱系可能是逆转免疫抑制 TME 和增强化疗反应最佳方法。

参考文献：
1.    Nywening, T.M., et al. Targeting both tumour-associated CXCR2(+) neutrophils and CCR2(+) macrophages disrupts myeloid recruitment and improves chemotherapeutic responses in pancreatic ductal adenocarcinoma. Gut 67, 1112-1123 (2018).