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编者按：十九大明确提出“坚持中西医并重，传承发展中医药事业”。中医药相关的项目成为近年来国自然资助的重点方向。中医学资助的范围主要包括四部分，中医基础理论、中医临床、针灸推拿和民族医学。近年来国自然基金比较关注中医基础理论、鼓励学科交叉研究，及在中医药理论指导下，运用多学科理念、方法、技术与手段进行跨学科协作研究。 常见的中医药课题思路类型如下：
★文献推荐★ 今天解读的文献是来自广州中医药大学第二临床学院中西医结合学科肿瘤中西医结合研究中心于2021年8月30日发表在Cell Communication and Signaling（IF=5.7）上题为“Aiduqing formula inhibits breast cancer metastasis by suppressingTAM/CXCL1-induced Treg differentiation and infiltration”的文章，即爱毒清方通过抑制TAM/CXCL1诱导的Treg分化和浸润抑制乳腺癌转移。 ★研究概述★ 乳腺癌转移是其引起患者死亡的主要原因。中医药因其在延长生存期和调节免疫平衡方面的优势而在亚洲国家受到重视。然而，潜在的分子机制在很大程度上仍然未知。这项研究不仅为ADQ抑制乳腺癌转移提供了临床证据，还为TAM/CXCL1/NF-κB/FOXP3信号有望作为Treg调节和乳腺癌免疫治疗的新靶点提供了思路。 分子机制图 ★研究内容★ 1、ADQ抑制乳腺癌的肺转移并重塑其免疫抑制性TME 根据人与小鼠之间的等效剂量转换，通过口服强饲法以0.7g/kg/天或1.4g/kg/天的剂量施用ADQ（图1a）。ADQ显著延迟了4T1-Luc异种移植物的生长，而对小鼠死亡率或体重无明显影响。（图1b、c）。此外，ADQ显著抑制了乳腺癌的肺转移，表现为肺转移病灶面积和数量的减少（图1d）。ADQ显著提高了TME内TIL的浸润水平（图1e）。ADQ处理显著增加了细胞毒性CD8 T细胞的浸润，同时减少了TME内免疫抑制性CD4 /CD25 /FOXP3 Treg的浸润（图1f）。ADQ还显著抑制了CD4 /CD25-/CD45RA 初始CD4 T细胞的浸润（图1f）。 图1 2、ADQ在体外和体内抑制TAM的M2表型极化和CXCL1分泌 ADQ处理（0.7或1.4g/kg/天）显著降低了TME内TAM的浸润和M2表型极化（图2a）。免疫荧光测定表明，ADQ显著降低了乳腺肿瘤组织中CD206（M2表型标志物）和CXCL1的表达水平，表明ADQ能够显著抑制TAM浸润并减弱体内CXCL1表达（图2b）。通过重组鼠IL-4和IL-13诱导将Raw264.7巨噬细胞转化为M2样巨噬细胞（图2c）然后进行ADQ处理。当用20-200μg/ml ADQ处理48小时时，TAM增殖被显著抑制，但在12或24小时时不显著（图2d）。此外，ADQ处理24小时以浓度依赖性方式显著抑制Raw264.7衍生的TAM的M2表型极化（图2e，f）。蛋白质印迹、ELISA和qPCR测定进一步证实ADQ抑制了TAM中CXCL1蛋白的表达、分泌以及mRNA转录（图2g-i）。最后，双荧光素酶报告基因测定显示ADQ抑制TAM中的CXCL1启动子活性（图2j）。 图2 3、TAM/CXCL1信号促进Tregs的分化和免疫抑制功能 通过敲低Raw264.7衍生的TAM中的CXCL1表达来生成TAM/shCXCL1细胞（图3a）。同时，通过荧光激活细胞分选技术从小鼠脾脏中分选初始CD4 T细胞（图3b）。TAM/CXCL1信号对初始CD4 T细胞增殖没有影响（图3c）。然而，TAMs的条件培养基(CM)能够显著诱导初始CD4 T细胞分化为Tregs，而TAMs中的CXCL1敲低(TAM/shCXCL1-CM)部分消除了这种作用（图3d）。趋化性分析表明TAM-CM促进了初始CD4 T细胞的趋化性，而TAM中的CXCL1敲低部分消除了这种作用（图3e）。从小鼠脾脏中分选Tregs和效应CD8 T细胞（图3f），TAM/CXCL1信号预处理Tregs不影响共培养CD8 T细胞的增殖活性，但显著诱导其凋亡和溶细胞功能失活，导致CD8 T细胞对癌细胞的杀伤作用降低（图3g，h）。 图3 4、CXCL1招募外周初始CD4 T细胞并通过激活NF-κB/FOXP3通路诱导其分化为Tregs CD62L 初始T细胞主要位于乳腺肿瘤组织内的血管周围，而Tregs分布在距离血管较远的地方（图4a）。同时，从乳腺肿瘤中筛选出的90%以上的初始CD4 T细胞表达CXCR2，高于非初始CD4 T细胞（图4b）。CXCL1的梯度浓度（10-30ng/ml）显著增加了初始CD4 T细胞的趋化效应，而使用2μMSB225002（CXCR2抑制剂）阻断CXCL1/CXCR2则可部分消除这种效应（图4c）。这些结果表明CXCL1可能会将外周CXCR2 初始CD4 T细胞募集到乳腺肿瘤中。人胚胎肾293T细胞蛋白质印迹分析发现CXCL1处理通过激活FOXP3基因的启动子活性（图4g）显著诱导FOXP3的蛋白质（图4d，e）和mRNA表达（图4f）。CXCL1能够诱导p65（NF-κb亚基）表达和核易位（图4h，i），而阻断CXCL1/CXCR2可以部分消除这种影响。CHIP-PCR测定证实CXCL1促进NF-κb亚基p65与FOXP3启动子区域的结合，而10μM Bay11-7082（NF-κb抑制剂）处理部分消除了这种作用（图4j）。这些结果表明CXCL1可以诱导p65表达和核易位，从而在转录上提高FOXP3表达并促进Treg分化。 图4 5、ADQ在体外抑制TAM/CXCL1诱导的Tregs分化和免疫抑制功能 浓度范围为20至200ug/ml的ADQ仅对初始CD4 T细胞增殖表现出中等抑制作用（图5a）。然而，ADQ显著抑制TAM/CXCL1诱导的初始CD4 T细胞分化为Tregs（图5b）。机理研究表明，ADQ显著抑制了293T细胞（图5c）和初始CD4 T细胞（图5d）中TAM/CXCL1诱导的FOXP3表达。此外，用ADQ预处理TAM部分逆转了TAM/CXCL1诱导的Tregs对CD8 T细胞的免疫抑制功能，导致CD8 T细胞的凋亡减少和细胞毒功能增加（图5e-f）。 图5 6、ADQ通过抑制TAM/CXCL1/Treg通路抑制乳腺癌免疫逃逸和肺转移 ADQ治疗还显著延迟了TAM与4T1-Luc细胞共同注射诱导的乳腺肿瘤生长，而将CXCL1过表达的TAM与4T1-Luc细胞共同注射则消除了这种影响（图6a-c）。体内成像测定和HE染色测定均表明ADQ显著抑制了乳腺癌肺转移，这一现象被与4T1-Luc细胞共同注射的TAM中的CXCL1过表达消除（图6d）。就免疫抑制性TME而言，ADQ通过抑制TAM/CXCL1活性显著提高了TME内TILs的浸润（图6e）并诱导癌细胞凋亡（图6f）。此外，ADQ给药显著降低了Tregs和初始CD4 T细胞的浸润水平，这与TAM/CXCL1活性密切相关（图6g）。 图6 2021年度国自然医学部国自32大科研热点的中标数统计如下：
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