【原】不同细胞系对细胞穿透肽的摄取和机制比较

作者：马冬旭, 齐宪荣

摘要:

细胞穿透肽 (cell-penetrating peptide, CPP) 作为一种潜在的药物输送高效转运载体一直得到研究者的广泛关注。本文中采用 4 种肿瘤细胞系 (MCF-7、MDA-MB-231、C6 和 B16F10) 分别摄取异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) 标记的 CPP, 观察到 CPP 入胞, 并具有时间和浓度的依赖性, 同时发现了 C6 细胞对 CPP 的胞吐作用, 其胞吐动力学符合零级方程; 在低温 (4 ℃) 和内吞抑制剂存在条件下探讨了 CPP 入胞的机制。低温条件对 CPP 的入胞未产生抑制作用; 肝素钠作为细胞表面硫酸糖蛋白受体抑制剂对 CPP 的入胞有 较强抑制作用, 肝素组对 CPP 的摄取只达到对照组的 3%～10%; 而氯丙嗪、氯喹和 N-乙酰基-N-异丙基阿米洛利 [5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride, EIPA] 对 CPP 的入胞影响不大。本研究表明, CPP 穿透细胞没有选择性, 即缺乏细胞特异性, 但 CPP 的摄取量与细胞种类有关。硫酸蛋白聚糖的吸附介导在 CPP 穿透细胞中发挥了重要作用。

细胞穿透肽 (cell-penetrating peptide, CPP) 是一系列能够快速穿透细胞脂质膜的小于 30 个氨基酸的短肽, 也被称为蛋白质转导域 (protein translocation domain, PTD)[1]。CPP 可以携带难以穿透细胞膜的大分子生物活性物质 (蛋白质、多肽、核酸片段等) 进行细胞内的传输, 也可以与肽或蛋白质连接易位进入细胞内, 并且毒性低, 不会产生细胞膜损伤。作为一种有潜力的药物输送载体, CPP 在药学领域具有很大的研究价值。

然而, CPP 的入胞机制至今尚不十分明确。在评估 CPP 的细胞摄取过程中, 不同的研究之间常常出现不一致的现象。这是由于比较时忽略了所用载体、药物分子、浓度、细胞类型和药物分子的物理化学性质等[2]。综合来看, 影响 CPP 内化机制的主要因素有: ① 温度; ② CPP 浓度; ③ 所用的细胞系; ④ 细胞周期; ⑤ 药物分子大小及其理化性质; ⑥ 非固定化细胞中不同的亚细胞分布类型; ⑦ CPP 的理化性质 (氨基酸构成、分子大小和分子构象等); ⑧ 细胞内 CPP的降解; ⑨ 早期 CPP 从内涵体中的逃离速度; ⑩CPP 所结合配体的荧光强度等[3]。从目前的研究结果来看, CPP 与小分子的结合物的入胞机制是通过静电作用或易位、跨膜转导作用; 而 CPP 与大分子的结合物是通过能量依赖的吞作用进入细胞[4]。大量研究表明, 尽管与其他生物大分子转运方式相比, CPP 的运载潜能有很多独特之处, 但在其应用中仍然存在很多困扰。一个比较突出的问题是 CPP可携带转运的活性物质分布于身体的各个部分, 缺乏细胞选择性。针对此点, 研究者设计了各种使 CPP靶向释放的药物传递系统, 例如将 CPP 的细胞穿透活性屏蔽, 直到 CPP 达到靶向组织细胞周围后再释放[5]; 也有研究者利用靶向组织分泌的蛋白酶敏感的化学键将 CPP 与某种药物分子连接, 从而使药物分子聚集在靶组织中[6]。

为了增加 CPP 的细胞选择性, 设计了可活化的细胞穿透肽 (activated cell-penetrating peptide, ACPP)。ACPP 在肿瘤处可被高表达的蛋白水解酶水解, 释放出 CPP 发挥细胞穿透功能。为了验证该 CPP (蛋白水解酶裂解后的活性部分, 序列为 NH2-Gly-Leu-ProLys-(FITC)-(Arg)9-COOH) 的细胞穿透能力, 采用FITC 标记 CPP, 在 MCF-7、MDA-MB-231、C6 和B16F10 等 4 种肿瘤细胞系中考察了时间和浓度对细胞穿透的影响, 此外, 使用不同的内吞抑制剂对该CPP 的入胞机制进行了探讨, 为 ACPP 作为载体转运生物活性物质奠定了理论基础。

材料与方法

药品与试剂 MCF-7、MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞株)、C6 (鼠脑胶质瘤细胞株) 和 B16F10 (鼠黑色素瘤细胞株) 均来自北京协和医学院细胞培养中心。DMEM 培养基、MEM 培养基、F10 培养基、1640培养基和青霉素-链霉素均购自北京迈晨生物技术有限公司; 胎牛血清 (FBS) 和马血清 (HRS) 购自武汉三利生物有限公司; 胰酶、乙二胺四乙酸 (EDTA) 和 FITC 购自美国 Sigma 公司, 组织细胞固定液 (北京赛驰生物试剂有限公司), 肝素钠注射液 (北京万邦生物科技, 2 mL: 12 500 u), 氯丙嗪和氯喹 (湖北弘景化学试剂公司提供, 纯度>98%), 5-(N-ethyl-Nisopropyl) amiloride (EIPA, 美国 Alexis Bioche)。其他实验试剂均为分析纯。FITC 标记 CPP [NH2-GLPK (FITC) RRRRRRRRR-COOH] 。

仪器 COIC/XDS-1B 倒置显微镜 (重庆光学仪器厂), Napco series 5400 CO2 培养箱 (Sanyo Electric Co. Ltd., 日本)。流式细胞分析仪 (Beckton Dickinson, 美国), 5810R 细胞离心机 (Eppendorf, 美国)。细胞培养 MCF-7 细胞培养于 37 ℃, 5% CO2 环境中, 采用 DMEM 完全培养基 (含 10% FBS, 1% 非必需氨基酸, 1% 谷氨酰胺以及青霉素- 链霉素双 抗液); 隔天更换培养液, 每 2 天按 1∶3 比例传代。MDA-MB-231

细胞培养于 37 ℃, 无 CO2 环境中, 采用 MEM 完全培养基 (含 10% FBS, 1%非必需氨基酸, 1%谷氨酰胺以及青霉素-链霉素双抗液); 隔天更换培养液, 每 3 天按 1∶3 比例传代。C6 细胞培养于37 ℃, 5% CO2环境中, 采用F10 完全培养基 (含 35% HRS, 5% FBS, 1%非必需氨基酸, 1% 谷氨酰胺以及青霉素-链霉素双抗液); 隔天更换培养液, 每 3 天按1∶4 比例传代。B16F10 细胞培养于 37 ℃, 5% CO2环境中, 采用 1640 完全培养基 (含 10% FBS, 1%非必需氨基酸, 1%谷氨酰胺以及青霉素-链霉素双抗液); 隔天更换培养液, 每 2 天按 1∶4 比例传代。

流式细胞分析 MCF-7、MDA-MB-231、C6 和等 4 种肿瘤细胞培养至对数生长期后, 按细胞数为 1×106/孔接种于 6 孔板。接种 24 h 后, 6 孔板内加入用各自细胞对应的空白培养基溶解的 10 μmol·L−1 CPP, 分别孵育 0.5、1 和 2 h; 或者分别用 5、10 和 20 μmol·L−1 的 CPP 孵育 1 h 后, 吸去孔内培养基, 用磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4) 漂洗 3 遍, 加入用 PBS 配制的胰酶消化液 (0.25%胰酶, 0.02% EDTA, PBS 配制) 消化 3 min, 加入适量血清终止消化, 离心, 用 PBS 离心清洗 2 遍。最后用 PBS 0.5 mL 吹散细胞, 经细胞筛过滤至流式细胞管中, 用流式细胞仪进行荧光测量。每种细胞系同时进行不加入 CPP 的空白对照组。

内吞抑制剂对 CPP 入胞的影响 4 种内吞抑制剂: 肝素钠 (PBS 溶解, 终浓度 10 μmol·L−1)、氯丙嗪(PBS 溶解, 终浓度 30 μmol·L−1)、氯喹 (PBS 溶解, 终浓度 10 μmol·L−1), EIPA (DMSO 溶解, 终浓度 10 μmol·L−1) 配成母液, 0.22 μm 滤膜过滤灭菌。使用时用细胞对应的空白培养基稀释至终浓度, 与细胞孵育30 min 后细胞孔内加入CPP (终浓度: 10 μmol·L−1), 孵育 1 h, 吸出含有抑制剂和 CPP 的培养基, 按照流式细胞分析步骤操作, 使用流式细胞仪测量胞内荧光值。每种细胞系同时进行不加入 CPP 的空白组和不加入抑制剂的对照组。

结果

1 孵育时间对 CPP 入胞的影响

10 μmol·L−1 CPP 处理 B16F10、MDA-MB-231、C6 和 MCF-7 细胞不同时间后, 用流式细胞仪检测细胞内的荧光强度, 结果见图 1。随着孵育时间从 0.5 h延长到 2 h, MCF-7、MDA-MB-231 和 B16F10 细胞内的荧光强度逐渐增强; C6 细胞 2 h 的荧光强度低于0.5 和 1 h 的荧光强度

2 C6 细胞的胞吐现象

CPP 在 C6 细胞中的荧光强度不随着孵育时间增加而增加, 细胞中的荧光强度在孵育时间为 1 h 时达到峰值 (图 1)。因此, 设计了以下实验以证实 C6 细胞对 CPP 的胞吐作用: 10 μmol·L−1 CPP 处理 C6 细胞1 h 后, 用 PBS 漂洗3 遍, 换等体积的空白培养基, 分别在 0.5、1、1.5 和 2 h 时间点, 按照流式细胞分析操作对C6细胞进行处理, 用流式细胞仪测量C6细胞的荧光强度值 (图 2)。在细胞外液换成空白培养基的0.5～2 h 过程中, 细胞内荧光强度逐渐降低。用细胞荧光强度对时间 (t) 进行线形回归分析, 可得零级动力学方程

3 CPP 浓度对 CPP 入胞的影响

用不同浓度的 CPP 处理 B16F10、MDA-MB-231、C6 和 MCF-7 细胞系 1 h, 用流式细胞仪检测细胞内的荧光强度, 结果见图 3。随着浓度不断增加, 4 种细胞系的细胞内荧光强度均有显著提高。

4 温度对 CPP 摄取的影响

选取 MCF-7 作为代表, 考察 CPP 在 4 ℃的入胞情况, 结果见图 4。在 4 ℃时, CPP 的入胞没有受到显著抑制, 在 0.5 和 1 h 时胞内荧光强度值略高于 37 ℃时的荧光强度值。

5 内吞抑制剂对 CPP 入胞的影响

选择 4 种细胞内吞抑制剂考察不同抑制剂对CPP 入胞情况的影响。肝素: 细胞膜表面硫酸蛋白聚糖的竞争抑制剂; 氯丙嗪: 笼型蛋白依赖内吞抑制剂; 氯喹: 抑制内含体酸化的内吞调节剂; EIPA: 大分子内吞必需的 Na+/H+离子泵抑制剂。从图 5 中可以看出, 肝素对 4 种肿瘤细胞 CPP 摄取的抑制最强。加入肝素后, 对 CPP 的摄取只达到对照组的 3%～10%, 其中 MCF-7 细胞对 CPP 的摄取只是原来的 3.2%。但氯丙嗪、氯喹及 EIPA 对 CPP 摄取的抑制均不明显。

讨论

CPP 的入胞具有时间和浓度的依赖特点, 随着孵育时间延长 (图 1, C6 细胞从 1～2 h 例外) 和 CPP浓度增加 (图 3), CPP 的入胞量随之增加。CPP 与 4种细胞系孵育后都表现出细胞内的荧光强度增加, 说明 CPP 穿透细胞没有细胞选择性, 即缺乏细胞特异性, 但 CPP 的摄取量与细胞种类有关, 4 种细胞中MCF-7 细胞对 CPP 的摄取最敏感。C6 细胞系对 CPP 有胞吐作用。在孵时间对CPP 入胞影响的研究中, CPP 与 C6 细胞孵育时间从0.5 h 到 1 h, 细胞中的荧光强度增加, 但随着时间从1 h 到 2 h, 细胞内的荧光强度反而下降。对出胞过程进行监控 (图 2), 发现在 2 h 内该胞吐过程符合零级动力学方程 (r = 0.992 3)。值得注意的是, 在浓度影响的研究中, 高浓度 CPP 的入胞量未因 C6 的胞吐作用而减弱, 这说明 C6 的胞吐作用并非因为 CPP 的浓度过高所致。

至今主要有两种主要的模式解释 CPP 的入胞机制: 转导模式和内吞模式[7]。转导模式包括直接穿膜和跨膜转导模式。在转导模式下, CPP 可通过直接穿膜、打孔、地毯式或形成反转微团的形式进入细胞[4], 这种情况即使在 4 ℃条件下也能发生[8]; 内吞模式包括网格蛋白、小窝蛋白和巨胞饮介导的模式[9]。在内吞模式下, CPP 通过不同的囊泡进入细胞, 然后释放入胞浆和胞核[10]。低温 (4 ℃) 条件下, MCF-7 对 CPP 的摄取未因温度降低导致细胞 ATP 消耗而减弱 (图 4)。该结果支持上述第1种入胞机制, 即单独的CPP通过转导模式进入细胞。肝素作为最常用的硫酸蛋白受体竞争性抑制剂, 对 CPP 的入胞有显著的抑制 (图 5), 说明在37 ℃下硫酸蛋白聚糖的吸附介导发挥了重要作用,

不论何种入胞机制, CPP 吸附到细胞膜上的量越多, 进入细胞的机会就越多。氯丙嗪作为笼型蛋白抑制剂的机制是使笼型蛋白在内涵体膜上聚集, 同时阻止细胞膜上内陷小窝的形成[11]。在本实验中, 氯丙嗪对CPP 的入胞无抑制作用, 这表示在本实验条件下细胞摄取 CPP 为非笼型蛋白依赖内吞。另一方面, 有报道氯丙嗪可以改变肿瘤细胞膜流动性, 增大细胞质膜间隙, 导致细胞膜通透性增大[12], 可能与氯丙嗪增加 C6 细胞的 CPP 摄取有关, 但还需要进一步研究证实。氯喹是可以调节内吞作用中溶酶体酸化的溶酶体抑制剂[13, 14]。加入氯喹后细胞内 CPP 的荧光强度略有增加。Lenman 等[15]证明氯喹可抑制溶酶体分解入胞肽, 从而导致肽的入胞量增加。EIPA 是大分子内吞 Na+/H+离子泵抑制剂[16], 除 C6 细胞外, 其对其他肿瘤细胞系的 CPP 摄取均没有明显作用。而Duchardt 等[17]的研究中发现EIPA 促进了CPP的细胞摄取。这表明在本研究的浓度和时间条件下, CPP 的入胞与 Na+/H+离子泵交换无关, 为非内吞作用。EIPA对 C6 细胞 CPP 摄取的抑制作用, 是否与该细胞系的胞吐作用相关, 尚有待进一步研究。如前所述, 影响CPP 入胞的因素很多。在不同细胞系中抑制剂对 CPP的入胞的影响不同。除了影响 CPP 入胞的因素外, 尚可能与细胞对抑制剂的敏感程度不同有关。但必须指出, CPP 携载大分子物质 (蛋白质、多肽、核酸片段、纳米粒等) 的入胞机制与 CPP 自身的入胞机制有所不同。

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