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2022年AACR会议上，随着以FRa为靶点的ADC-PRO1184临床前数据地公布，普方生物“以EXD作为payload，新型亲水性linker改造”的平台第一次在大众面前亮相。从当时的公开信息看，并看不到平台最核心的部分，即亲水linker的结构。  同年8月和11月，随着PRO184临床实验相继获得FDA和NMPA批准，今年1月，其linker专利信息WO 2023280227A2终于公开，结合之前抗体部分的专利WO 2022217022A1，本篇我们来捋一下该ADC分子的开发。 01 — 靶点选择 FR（Folate receptor，叶酸受体）家族通过GPI锚定于细胞膜的单链糖蛋白，能够结合叶酸并通过内吞作用转运叶酸进入细胞。FR 有α，β，γ，δ 4种亚型，分别由基因FOLR1，FOLR2，FOLR3，FOLR4编码。其中Folate receptor alpha即FOLR1的研究最广泛。 FRα, 是38-40KD的肿瘤相关抗原，主要在上皮来源的肿瘤组织中高表达比如卵巢癌、TNBC和肺癌，在正常组织中不表达或者极低的表达。 对于ADC来说，我们更关心细胞表面抗原的个数，这一点普方也做了检测。可以看到，在卵巢癌、口腔上皮癌中，FRa的抗原个数可以超过10^5，基本是trop2高表达的水平。
图 不同细胞系表面FRa抗原个数 02 — 抗体发现 WO 2023280227A2专利Example 67-70以及WO 2022217022A1是抗体发现的过程，总的来说，采用的是全人源噬菌体库，通过4轮噬菌体淘选，筛出来了12个候选抗体序列。 然后表达抗体，通过检测抗体表达量，和人猴抗原交叉以及流式细胞结合，内吞以及偶联后的理化性质，筛选出了一株F131的抗体。 抗体发现已经是常规技术了，看一下最后筛选数据结果即可。 KD值在10的-9，做成ADC 不影响KD。同时和猴FRa抗原交叉，和鼠，这个数值就算不交叉了。 表 抗体及ADC的亲和力数据
内吞的话，在中高表达细胞系中，也能到40%以上。
图 抗体及ADC在不同细胞系的内吞数据 03 — Linker-payload开发 总的筛选思路： 1、接头方面，除了传统的马来酰亚胺的接头，也尝试做了一些线性的接头； 2、裂解不可裂解方面，采用的传统的VC-PABC的形式，即可裂解的linker; 3、亲水性方面，以PEG的linker作为基础，后面接着不同个数的葡糖胺（2-8个）或者硫酸根、磷酸根、葡萄糖这种亲水集团； 4、payload除了喜树碱EXD，也做了微管抑制剂MMAE等不同的组合。 最终筛选出来的linker-payload结构如下：即马来酰亚胺接头，后面串上VC-PAB-EXD，同时把亲水链的位置接在VC前面的氨基酸上，命名为PA038。
图 临床分子的结构 3.1 以MMAE为payload的对照分子 不学化学的人看上面结构真的是头疼对不对，我们把专利后面药效实验时用来和PA038做对照的2个分子PA101和PA110拿出来划一下，再去和上面的结构对，应该能清楚一些，这两个分子用的payload均为MMAE，DAR值为8。  图 PA101结构  图 PA110结构 3.2 以EXD为payload的对照分子 药效同时做对比的还有一个PA100和PA111的分子，这两个分子用的payload均为EXD，DAR值为8。PA100结构上比最后的临床候选分子亲水基团增加了1倍，而PA111则在PA100的基础上又多了2个葡糖胺基团来亲水。如下图： 图 PA-100结构  图 PA-111结构 04 — 候选ADC的药效分析 首先看最后的临床候选分子PA038的药效，可以看出在细胞表面抗原个数＞4*10^4细胞系中，5mg/kg的临床候选ADC，一针均能明显抑制小鼠瘤子生长。
图 PA038在4种PDX模型中药效 既然目的是增加亲水性，先来看看同为EXD做payload，增加亲水性后的两个分子PA100和PA111，和临床候选ADC-PA038的药效相比呢？可以看到，相同剂量下，药效差别不大。
图 PA100和PA111在KB细胞系的PDX模型中药效 那和MMAE payload的ADC相比，药效如何呢？和临床候选ADC-PA038的药效相比，相同剂量下，PA110表现出了剂量依赖关系，同时看图药效应该是好于PA038的，而PA101低一倍剂量的情况下，看起来药效也是优于PA038的，动物药效上这个结果不难理解，MMAE通常情况下，活性就是优于EXD的，更何况，这个MMAE偶联的还是DAR8。
图 PA110和PA101在KB细胞系的PDX模型中药效 事已至此，这个时候大家肯定想到要去比比药代以及安全性了。 05 — 药代分析 ADC的药代一般分为3部分，抗体、完整ADC、掉落payload。一般而言，抗体和掉落的payload之前的技术都非常成熟，一个用Elisa，一个用质谱即可完成检测，而完整ADC的检测则需要用到一个抗小分子的抗体，这部分试剂目前也逐渐有商品化可选，但在早些时候，还需要自己去做，都是时间成本。普方这些数据去年4月就公布了，所以公开信息上所有的药代均只有抗体的数据，而无完整ADC和掉落payload的数据。 先看看药效比较好以MMAE为payload的PA101 和PA110的药代数据，可以看到，ADC的抗体和正常裸抗打进去之后无异。
图 PA110和PA101在大鼠中药代分析 再看看以EXD为payload的PA100和PA111的药代数据，也一样，ADC的抗体部分和裸抗打进去的一致。
图 PA100和PA111在大鼠中药代分析 那最终的候选分子呢？毫无疑问，只测抗体PK，这能有什么问题呢？
图 PRO1184在大鼠中药代分析 06 — 安全性分析 猴的安全性实验数据，只有最终的临床候选分子PA038（即PRO1184）进了决赛圈。食蟹猴体内毒理实验，60 mg/kg，给药一针的条件下，PRO1184的ALT,AST升高明显低于GGFG-DXD结构的ADC，EXD的活性是高于第一三共的DXD的，该实验的数据说明耐受性会比第一三共结构的分子更好一些，也预示着会有更大的安全窗口。
图 PRO1184在食蟹猴中安全性数据 07 — 总结 普方的管线看，目前除了正在临床I期FRa为靶点的PRO1184外，还有一款进展较快的是以CD70为靶点的ADC——PRO1160。 就FRa靶点而言，2022年11月14日，ImmunoGen的FRα ADC新药Mirvetuximab soravtansine已经获得了FDA批准上市，用于治疗铂类化疗耐药的卵巢癌，商品名为Elahere。华东医药拥有该药物的大中华区权益。而此后，ImmunoGen开发了新一代的FRa ADC-IMGN151，希望通过FRa双表位的策略做成双抗ADC使低表达的肿瘤患者中也能获益。 亲水linker改造，目前进展中的也很多，增加PEG来提高亲水性是大家会通常采取的策略，另外，国外Mablink开发了采用poly-sarcosin（聚肌氨酸）增加水溶性的linker，就亲水性而言，poly-sarcosin优于PEG，专利是2022年出来的；管线的话，目前都还在临床前。而国内，最近普众&艾比玛特（同一个创始人孟逊)发表了一个paper, 也是关于poly-sarcosin做linker的，payload用的EXD，paper数据很完整，药效、药代和安全性优势看起来也很明显，据说后面也是要推临床；专利的话是2022年11月公开的。  |
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