| 酶联免疫斑点技术（enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT）是1983年由Gzerkinsky等根据酶联免疫吸附试验而建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学新技术。T-SPOT是结核菌感染T细胞斑点试验，用于检测结核菌感染后特异性T细胞分泌的γ干扰素（INF-γ），并根据此结果判断是否感染核。2001年，Lalvani首先将ELISPOT技术用于结核病的诊断，此后相关报道日益增多。据WHO（世界卫生组织）统计，全世界有超过1/3的人曾经感染过结核分支杆菌，《2012年全球结核病报告》显示，在2011年有870万新发病例，140万人死于结核病，而且这个数字逐年增加。我国是全球22个结核病高负担国家之一，发病率仅次于印度，耐多药结核病患病人数高居全球第1位，因结核感染导致的死亡人数是其他传染病总死亡率的2倍以上。而且，结核病的表现形式多种多样，并可累及全身各组织、器官，除了毛发、指（趾）甲外，几乎均可受感染。由于结核病(尤其是肺外结核)的早期病变比较隐匿，给临床诊断带来极大地困难，而且这一类患者通过常规胸片，CT，痰涂片镜检可能查不到病变及细菌，这就有可能成为潜在传染源而危害公众健康安全。目前结核分枝杆菌的主要检测方法有结核菌素（PPD）皮试，结核菌涂片、染色和镜检，分枝杆菌分离培养，组织病理学检查，结核抗体检测，结核蛋白芯片，结核菌PCR检测等。临床数据显示，不同的检测方法对结核分枝杆菌感染的检出率均有一定的效果，但同时也发现有假阳性反应或受标本的影响（如应该留晨痰标本的结果留的是唾液）而出现假阴性的情况。既往的结核菌素实验（PPD皮试）是长期以来用以快速诊断结核菌感染的唯一手段，但在普遍接种PPD的地区存在有“假阳性”情况，而且对于结果的判读存在有人为误差的可能。对于因HIV感染等免疫功能低下的患者可能还有无反应性的结果，这就如同感染了乙肝病毒变异株而用常规的ELISA方法检测不到乙肝病毒一样。因此，需要寻找一个更加敏感而且快速的方法来诊断结核菌感染。分子生物学方法以其简便、快速、特异性高的特点成为结核分枝杆菌检测研究的热点。国内外大量研究证明PCR检测结核分枝杆菌敏感性达到100%。但采用荧光PCR对待检测样本中遇到病灶排菌量少，或处于排菌间歇期，则无法检测到样本中的结核分枝杆菌，故菌阴结核的检测需要联合其他方法才能确诊。这有点类似于用定性PCR检测不到乙肝病毒（HBV）而通过定量方法才能发现HBVDNA，与其有“异曲同工”之妙。T-Spot.TB技术于2004年在欧洲，2005年在加拿大被批准使用，美国FDA于2008年审批用于临床诊断。它是以ELISPOT技术检测结核菌的一种新方法，相当于检测HBV的斑点杂交技术，可以检测出1/100000~1/500000外周血单个核细胞（PBMC）中经抗原刺激产生的细胞因子，用ELISPOT分析系统进行斑点计数，从而计算出抗原特异性细胞出现的频率。由于结核菌感染后会长期存在记忆性T细胞（即使康复后也可能存在），当再次受到抗原的刺激后，能迅速活化增殖，并且释放γ干扰素，这样通过检测γ干扰素的活性就可反推是否感染结核菌。临床实践证明，T-Spot具有快速、敏感和良好的特异性。有症状的结核病通常可以通过痰涂片及培养，影像学诊断而确诊，但对肺外结核的诊断比较困难（特别是针对儿童），而且对于潜伏性结核（即没有临床症状，胸片或CT扫描正常，传统PPD试验阴性，痰检等均为阴性者）用传统的方法无法确诊，使得部分患者成为“隐性传染源”而危害公众健康。由于血清学检测方面，试剂的灵敏度低，不能区分既往感染和现症感染患者，2011年7月20日，WHO发表正式声明，要求禁止将血清学检测方法（抗原、抗体、蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。T-Spot技术利用效应T淋巴细胞再次受到结核菌抗原刺激时会分泌特异性细胞因子的原理，检测结核菌感染比其他方式更加灵敏，并且可用于结核菌潜伏感染的诊断，因此被列入美国、英国等欧美20多个国家结核病诊疗指南，而且美国CDC推荐将此项检测列为BCG（卡介苗）接种人群结核菌感染的首选检测方法。结核潜伏感染人群（LTBI）是一个庞大的结核病源库，是结核难以控制的根源所在。ELISPOT试验检测结核分枝杆菌抗原特异性T淋巴细胞，能够早期准确提供结核感染的证据，为儿童结核病临床诊断增加了一个诊断方式，对于临床诊断困难的不典型病例、临床急、危重症病例、营养不良患儿以及其他处于免疫抑制状态的患儿，ELISPOT试验将会是辅助诊断儿童结核病的较佳选择。诊断灵敏度达80%，特异性86%。该检查的优点：1.特异性95%左右，不受卡介苗接种与环境分支杆菌的影响2.灵敏度95%左右，几乎不受个体免疫功能低下的影响3.快速检测，24小时内可报告结果4.斑点数的意义：斑点越多越倾向于活动性结核、现症感染，并可作为疗效监测指标。国内文献报告，T-Spot检测结核的灵敏度为94.7%，在肺疾病组和肺外疾病组分别为95.6%和93.3%；特异性为84.1%，在肺疾病组和肺外疾病组分别为69.2%和88.9%。大量临床实践证明，T-Spot是诊断结核感染方面具有良好敏感性和特异性的方法，在鉴别活动性结核和潜伏结核感染，预测结核发病风险方面具有重要的意义，目前的检测技术其标本已不局限于痰、静脉血，在支气管肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液等也可用于肺结核及肺外结核的诊断，有的认为用其他体液标本检测的灵敏度还显著高于外周血标本，这样就为肺外结核病的诊断增加了一个快速确诊的方式。正如采用PCR（聚合酶链反应）及定量技术检测HBVDNA及/或HCVRNA用来判断HBV及/或HCV感染一样，T-SPOT逐渐成为在结核病诊断领域中具有革命性的方法而受到推崇并成为首选检测方法。 |
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