【专家论坛】宏基因组测序技术在虫媒传播疾病诊断中的应用与思考

文章来源：中华检验医学杂志, 2023,46(2) : 119-126

作者：王曼媛 魏慕筠 李敏

摘要

虫媒传播疾病是危及生命的严重传染性疾病，快速且精准病原学诊断是临床及时有效治疗并降低病死率、减少后遗症的前提。虫媒病实验室诊断以靶向性的血清学检测和聚合酶链反应为主，对少见虫媒病原体检出困难。目前，宏基因组二代测序技术（mNGS）已从科研走向临床应用。mNGS检测感染标本中全部生物的核酸序列并进行生物信息学分析，在少见病原体诊断和溯源方面具有显著优势。但同时mNGS也面临着整个操作流程中可能引入的背景微生物污染、数据库限制造成的错误结果、临床治疗亟需的病原体耐药性和宿主免疫状态等信息的挑战。该文主要就mNGS技术、其在虫媒病原体诊断应用及其所面临的挑战与难题等方面进行系统论述。随着mNGS在检测流程、检测结果分析和解读等方面不断优化，将为临床感染病病原学诊断带来新的发展与革新。

被节肢动物叮咬而感染发病的一类传染病称为虫媒传播疾病（以下简称虫媒病）^［1］。虫媒病可以分为虫媒性病毒传染病、虫媒性立克次体传染病、虫媒性细菌传染病、虫媒性螺旋体传染病和虫媒性寄生虫病等。常见的虫媒病病原体与传播媒介见表1^［1］。

虫媒病通过传播媒介将病原体传播给人类，主要的媒介动物包括蚊、蝇、白蛉、蠓、蜱、螨、蚤、虱等。虫媒病感染可致患者神经系统、呼吸系统等损伤，严重感染者甚至危及生命。虫媒病具有一定的时空特征性，即地区不同，流行的病原体大不相同。其发生和流行很大程度上由虫媒种类的地理分布决定。如西罗尼热、兔热病主要发生在北美地区；黄热病主要分布于非洲；我国的森林脑炎主要分布于存在原始森林的东北和新疆地区^［1］。近年来，由于国际交往和交通条件日益发达，传染病的病原体及媒介动物扩散到世界各地，导致虫媒病的传播和流行区域扩大。

一、虫媒病传统病原学诊断技术及局限性

虫媒病原体如立克次体、螺旋体等极少且很难通过病原体培养进行鉴定^［2］。病毒培养通常在哺乳动物和蚊子细胞系中进行，如非洲绿猴肾细胞（Verda Reno，Vero）、叙利亚幼地鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney，BHK）和幼蚊细胞C6/36^［3］，但其通常需要组织活检或在患者死后进行，且必须位于生物安全水平4级的实验室中。

血清中是否存在病原体特异性抗原和抗体是诊断急性或近期虫媒病原体感染的实验室方法之一。抗原方面可以通过样本与固体载体结合的“捕获”抗体反应进行检测；特异性抗体出现时间中位数在症状出现后的4~10 d，通常持续1~3个月^［4］，可通过急性期和恢复期血清之间的抗体滴度增加4倍或存在与中和抗体结合的病原体特异性抗体来诊断。但通过血清学检测很难在感染早期得到诊断，如地方性斑疹伤寒立克次体、贝纳柯克斯体等感染的血清学证据直到疾病的第2周才变得明显^［5］。并且还必须考虑先前感染的抗体长期存在或与其他病原体的交叉反应。

设计特定核酸引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种靶向性的分子生物学诊断方法^［4］，常规、巢式和实时PCR技术均已用于检测^［6］。由于这些技术只能特异性靶向检测某几个目标病原体，因此在检测前需要预先推测待测目标病原体种类。临床医生对许多虫媒病毒以及罕见的寄生虫感染等临床表型了解不多，病原学诊断往往较为困难。特别是对新出现和被消灭后再出现的致病病原体，包括埃博拉病毒、基孔肯亚病毒、寨卡病毒和波瓦生病毒等无法通过预先靶向性PCR及时发现。因此基于目前虫媒病传染现状，迫切需要新的诊断技术。

二、宏基因组二代测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）应用于虫媒病诊断

（一）mNGS

mNGS通过对标本中全部生物（人、病原体）的基因组构建宏基因组文库后，利用二代测序平台对数十万到数百万条核酸分子序列进行读取的技术^［7］。在测序过程中，样本中全部的核酸片段被直接提取并进行检测，经过生物信息学分析去除人源片段后，获得病原体的序列数、丰度等数据。临床样本的宏基因组学分析可以在一次分析中鉴定数据库已知基因组序列的病原体^［8］。当发现未知序列时，通过组装全基因组并与现有的病原体基因组进行差异比较和溯源，则有可能发现新的病原体。mNGS的优势包括：（1）病原谱覆盖广，可以实现广泛的病原体检测和混合感染的检测；（2）样本检测流程的周转时间较短，为18~55 h^［9, 10］；（3）无需培养的同时能检测出不可培养的病原体，减少漏检；（4）灵敏度和特异性较高^［11］。

（二）病原体鉴定

1.病毒：对于虫媒病毒，mNGS可以对疑似感染患者、免疫抑制患者、旅行后不明原因发热患者等多种人群进行诊断和发现新型病毒亚型，目前已经有多篇文献病例报道对此进行了研究和总结，见表2。

然而mNGS检测虫媒病毒还是存在一定假阴性的情况，这可能是由于分析前因素的影响或是整个操作流程中可能引入的背景微生物污染、数据库限制等原因造成，如Haston等^［26］发现mNGS未能成功检测出血清学检测阳性的加利福尼亚脑炎病毒；Hong等^［27］也报道了乙型脑炎病毒和登革病毒的mNGS假阴性结果。

2.细菌：在土拉热弗朗西丝菌诊断方面，Birdsell等^［28］通过对患者的颈部淋巴结细针抽吸物进行mNGS分析，均成功检测到了该菌的核酸序列并识别了合并感染的病原体。但目前暂未发现关于mNGS检测其他虫媒病细菌如鼠疫耶尔森菌的相关文献，可能因为此类虫媒细菌非常罕见，仅在个别地区散在发病，感染率很低；或是由于鼠疫耶尔森菌引起的感染属于甲类传染病，传染性极强，一般实验室无法进行检测操作，且目前有可以进行快速诊断的荧光素标记抗体染色法，病例症状明显，无需进行主要用于疑难病例诊断的mNGS技术。

3.立克次体：多例病例报告了利用mNGS确认并分型了虫媒立克次体感染，在血液、脑脊液、伤口组织、支气管肺泡灌洗液等样本中都检测到了明确的病原体，帮助减少漏诊、误诊的同时也改善临床抗菌药物用药，使得患者康复出院，mNGS检测不同虫媒立克次体的文献见表3。

4.螺旋体：2021年，Branda等^［39］利用血浆中的循环脱氧核糖核酸（circulating free deoxyribonucleic acid，cfDNA）对莱姆病进行早期诊断，证明了mNGS对早期莱姆病潜在的诊断价值，并且发现mNGS检测和急性期噻唑蓝比色法的结合可以提高诊断的临床敏感度至86%；Madugundu等^［40］则报告了一种新的诊断思路，该团队通过对从被蜱叮咬的个体身上采集的蜱的DNA和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）进行mNGS，识别了传播伯氏疏螺旋体的蜱类，从而确诊了莱姆病。

5.寄生虫：mNGS也逐渐成为诊断虫媒寄生虫的有力工具之一。虫媒性寄生虫病往往临床表型复杂、不典型且可能在短时间内危及生命，mNGS帮助临床及时鉴别诊断和救治，还能在复查中进行二次检测，有助于确定病媒和宿主的疾病进展、预防和控制。mNGS检测不同虫媒寄生虫的文献见表4。

（三）病原体溯源

mNGS还能通过对虫媒病原体的精确分型诊断，从而协助流行病学分析、系统发育分析和遗传关系溯源。多篇文献报道了通过mNGS检测到病原体的全基因组，再经由完整开放阅读框架生成系统发育树，从而确定病原体属于何种分离株及是否与疾病严重程度相关^{［50, 51］}。从虫媒病疫情暴发的角度，可以充分了解病原体的传播源头、传播途径和暴发时间^［52］，及时采取正确度相关措施并预防二次传播。与部分序列相比，使用全基因组序列进行系统发育分析的优势在于其更高的鉴别能力，从而能够正确识别暴发病原体^{［14，53］}。值得一提的是，Haryanto等^［54］通过直接从母亲和新生儿血清中分离的登革病毒核酸的mNGS检测显示了相同的登革病毒-2全基因组序列，证实了登革病毒垂直传播的发生。

三、mNGS应用于虫媒病检测的问题与挑战

（一）分析前因素影响检测结果

选择合适的时间和样本送检有时决定了是否能正确检出虫媒病原体。在时间方面，因为mNGS通常不会作为初筛实验，所以对于某些特定的病原体，如能引起脑膜炎的波瓦生病毒和寨卡病毒，由于疾病快速进展，很快就无法在脑脊液中检测到^［19］；而Q热自限性导致了在病程变化中，mNGS所能检出的病原体序列大不相同^［55］。在样本类型上，骨髓抽吸物比血液游离DNA更能检测出刚地弓形虫、利什曼原虫等虫媒寄生虫^{［48，56］}；而能引起脑炎的加州脑炎病毒，在脑脊液样本中的检测效果远高于血浆等其他样本^［26］；此外，样本送检时的各个环节如保存不当、反复冻融等原因也会导致一些罕见的虫媒病毒如埃博拉病毒的核酸在运输过程中被降解^［23］，从而造成了假阴性的结果。

（二）背景微生物污染不可避免

湿实验的各个步骤都可能引入外源微生物的核酸污染，如Asplund等^［57］报道了在DNA和RNA病毒库中发现了mNGS数据集的许多常见污染物（如细小病毒、浓核病毒）。尽管这些污染物可能来自实验室试剂（如提取试剂盒），但这可能会导致假阳性的结果。甚至由于一些非病毒类的虫媒病原体因基因组相对较小，测序覆盖率小，从而导致这些低剂量的生物样本信号被污染物掩盖^［58］。而为了进一步简化mNGS的检测流程和减少mNGS检测过程中一系列干湿实验室活动的不可靠性，除了建立每个mNGS实验室专用的核酸污染物数据库之外^［7］，Jia等^［59］开发一种基于Illumina的DNA/RNA文库制备和快速数据分析方案。不同于以往mNGS提取核酸的方法，该方案通过促溶剂半自动提取样本中的总核酸后，再利用磁珠进行纯化。随后基于一些逆转录酶的模板切换特性，开发了一种纳克级RNA文库制备方案。该法不仅降低成本、缩短了检测时间，并且结果显示病毒载量与比对参考基因的读数之间存在良好的相关性。

（三）检测灵敏性有待提升

mNGS用于虫媒病检测的灵敏度很大程度上取决于背景核酸水平^［10］。例如，与无细胞体液相比，组织样本增加了人体宿主背景，导致微生物读数的数量和比例减少，因此导致mNGS检测的敏感性降低。多例文献中都提及mNGS在血液样本中检出的虫媒病原体如地方性斑疹伤寒立克次体、汉坦病毒等序列读数较低^{［17，37］}。若是增加测序深度可以改善此类问题，但相应的检测成本会大大上升。

为了改良mNGS灵敏度的问题，目前已有多项研究基于mNGS研发了能对样本中的微生物进行正向和反向富集的新技术，分别通过靶向富集样本中的常见致病微生物和去除人源基因组以提高mNGS的检测灵敏度^［60］，如Deng等^［61］开发了带有加标引物富集（metagenomic sequencing with spiked primer enrichment，MSSPE）的宏基因组测序，此方法能同时富集靶向病毒序列并保留对其他病原体的宏基因组敏感性。该团队通过不同病毒的重叠基因组设计了13对通用引物，在测序的反转录过程中，将设计引物添加到含随机引物的反应混合液中，再利用特定捕获探针进行富集、扩增。方法评估结果表明，与单mNGS相比，MSSPE的富集增加十倍以上，基因组覆盖范围平均增加47%（±16%）。在感染患者血浆样本中检测寨卡病毒、埃博拉病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒和黄热病病毒的准确率为95%。

（四）不同测序平台数据库存在差异

由于mNGS仍然是较新的方法，还未大量投入临床诊断，故而对样品中病原体的鉴定没有一致的标准构成。有分析表明对于同一病原体，不同测序平台、不同数据库的选择都可能影响检测序列的差异^［62］。若选择相对覆盖率广、物种全面的核苷酸数据库，可能会由于高度同源区域等原因增加了错误结果出现的可能，Lizarazo等^［14］就曾讨论了由此所导致登革病毒检测结果的不准确性。而一些高质量数据库则因为收录的微生物有限，数据库内的数据不全，还需进一步完善，从而限制了检出率，可能会导致假阴性结果^［58］。

（五）mNGS用于耐药性检测尚不成熟

有研究人员对通过mNGS收集到的数据进行相关虫媒病毒的耐药性基因分析和预测^［63］，mNGS 检测耐药性基因存在较高的假阳性和假阴性，基因型与表型不一致，解释有一定难度，并且mNGS的结果解读需要由临床医生结合检测结果和临床病史作出综合判断^［64］，mNGS对耐药性的检测仍需在未来不断完善。

（六）mNGS用于评估宿主免疫状态尚缺少数据支持

不同疾病的炎症反应模式不同，mNGS可以对宿主转录物丰度进行分析，通过差异基因表达和基因富集分析从而评估宿主免疫状态^［65］。结合微生物组分析还可预测特定生物体的存在，或评估宿主对已知感染的反应情况^［66］。但目前mNGS对宿主免疫状态的检测仍需在不同疾病中的健康对照人群和患病宿主中积累更多数据与经验，以确定宿主差异基因表达与疾病的相关性，且效果必须进一步在大规模研究中验证^［67］。其次，较高的成本也限制了其作为诊断补充方法的常规使用^［66］。

四、总结与展望

不断增加的mNGS精准诊断虫媒病病例报道已经证明该技术的应用价值，这些病例有助于深入分析病原体感染以及其与临床表现的联系，还可根据测序结果在不同流行病学环境下设计疫苗。目前已经有越来越多的前瞻性临床试验，有助于了解在病程中何时进行mNGS，还可以用来分析该技术在改善患者预后方面的成本效益，以证明其使用的合理性，并支持监管机构批准和临床报销^［10］。

文库制备、核酸序列生成和生物信息学等技术的进步正在以较低的成本实现更快、结果更全面、灵敏度和特异性更高的宏基因组分析^［10］。希望在未来，mNGS成本花费和样本周转时间能进一步下降；计算机分析平台能持续优化，其在除了明确诊断方面的其他方面，如监测和跟踪新疾病暴发上，能实现早期检测和控制疫情；在病原体耐药性检测方面，mNGS测序深度和耐药基因数据库的不断完善将为临床精准治疗提供更有价值的信息^［68］。随着该技术的不断完善，mNGS将成为临床感染病原学诊断中重要的技术支撑。

参考文献（略）