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题目：Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation 刊名：Plant Physiology 作者：Guanghui Zheng，Chunying Kang et al. 单位：Huazhong Agricultural University, Wuhan 日期：06 October 2022    01 摘要  RNA导向的DNA甲基化（RdDM）是一种表观遗传过程，将沉默导向特定的基因组区域和基因座。RdDM的生物学功能在园艺植物中没有得到很好的研究。在这里，我们分离了甲烷磺酸乙酯诱导的突变体，该突变体在林地草莓（Fragaria vesca）中产生小叶子、花和果实，这是由于与野生型（WT）相比细胞数量减少。候选突变导致FvH4_6g28780中的过早终止密码子，该密码子与编码RdDM通路成分的拟南芥（Arabidopsis thaliana）DNA甲基化因子1（FDM1）具有高度相似性，并命名为FveFDM1。同样，CRISPR/Cas9产生的fvefdm1CR突变体也产生较小的器官。 在拟南芥fdm1-1fdm2-1双突变体中过度表达FveFDM1恢复了RdDM靶位点的DNA甲基化。FveFDM1与De Novo 2（FveIDN2）中涉及的同源物在蛋白质复合物中起作用。此外，全基因组亚硫酸氢盐测序显示，在fvefdm1中，DNA甲基化在整个基因组中显著减少，特别是在CHH环境中。与野生型组织相比，在fvefdm1的不同组织中鉴定了常见的和特异的差异表达基因。验证了几种赤霉素（GA）生物合成和细胞周期基因的DNA甲基化和表达水平。 此外，与WT相比，fvefdm1幼叶中GA和生长素的含量显著降低。然而，外源GA和生长素不能恢复fvefdm2的器官大小。此外，GA处理极大地诱导了FveFDM1、FveIDN2、核RNA聚合酶D1（FveNRPD1）、结构域重排甲基化酶2（FveDRM2）和细胞周期基因的表达水平。总之，我们的工作证明了FveFDM1在园艺作物中通过RdDM介导的DNA甲基化在植物生长和发育中的关键作用。 02 技术路线  将白果林地草莓（F.vesca）材料YW和夏威夷4号（H4）用作EMS诱变和稳定转化的WT EMS突变体ros的基因分离 对于FveFDM1 CRISPR，使用web CRISPR-P设计了两个靶向FDM1外显子的82 bp（sgRNA1:CCATACGAGCAGTTACGAAG）和404 bp（sgRNA 2:TGTTGAGCCAGCCAAAGGAC）的sgRNA，并通过Golden Gate Assembly克隆到二元载体pKSE401G中 草莓的稳定转化 细胞大小和细胞数量的检测 亚硫酸氢钠全基因组测序和数据分析 RNA sequencing 、small RNA sequence and data analysis Yeast two-hybrid assay、Co-IP assay and immunoblot analyses、Hormone measurement Hormone treatment 03 主要结果 3.1 F.vesca中的ros突变体在细胞增殖方面存在缺陷 为了鉴定草莓器官大小控制中的关键基因，我们筛选了F.vesca品种Yellow Wonder（YW）的EMS诱变M2群体，并发现了一个结构更紧凑的突变体（图1A）。该突变体名为ros，其叶片、花朵和果实比野生型小（图1B）。定量测量还表明，这些组织中ros的大小显著减少。此外，ros的果实形状指数（长度/宽度）减小，表明其果实比WT更圆。在整个果实发育过程中，ros果实大小小于WT，表明在果实开始前，ros花托的大小已经减小。 总的来说，ros突变体在营养器官和生殖器官中都表现出缩小的大小。为了了解ros中较小器官的原因，我们对叶片、花朵和果实中的细胞形态进行了研究。ros叶的总面积减少到WT叶的一半左右，同一区域中近轴侧叶表皮细胞的数量在ros中略有减少（图1，C和D）。随着花瓣尺寸的大幅减少，ros中花瓣的表皮细胞在与WT相同的区域中显示出减少的细胞数量（图1，E和F）。授粉后7天（DAP）果实的横截面显示，与WT相比，ros中的细胞更少（图1，G和H）。我们还发现花瓣背面表皮、叶柄横截面和玫瑰果实中的细胞越来越少。根据这些观察，ros较小的器官主要是由细胞数量减少引起的。
3.2 ros突变是由FveFDM1中的点突变引起的 回交F2群体以60:22的比例分离WT和突变体植物，表明存在单隐性突变。对20株F2 ros突变体和20株F2 WT植物的汇集幼叶进行测序，然后使用已建立的品系进行分析。共获得了位于Fvb6外显子区域的13个SNP（单核苷酸多态性）。其中，两个相邻的SNP（在350kb的距离内）分别导致FvH4_6g28780和FvH4-6g29230中的过早终止密码子。在78个F2 ros突变体的基因分型分析中，FvH4_6g28780中的SNP保持纯合，但FvH4-6g29230中的SNP在一个突变体中为杂合，表明FvH4/6g28780（注释Ver4）/基因15856（注释Ver2）是ros的主要候选。FvH4_6g28780与拟南芥FDM1（RdDM通路中的一种成分）具有高序列同一性（58%）。因此，该基因被重命名为FveFDM1，ros突变体被称为FveFDM1，突变位于第五外显子（图2A）。FveFDM1包含IDN2/FDM1基因家族的四个标志性结构域（Ausin等人，2009），即Zf XS、XS、螺旋线圈区和XH结构域。fvefdm1突变导致C末端XH结构域的蛋白质被截断（图2B）。 此外，在F.vesca基因组中发现了两种其他IDN2/FDM同源物FveIDN2和FveFDM2（图2C）。根据F.vesca中的转录组数据，FveIDN2表达最丰富，FveFDM2表达最少，但总体而言，它们中的每一种都在检查的组织中普遍表达（图2D）。在烟草叶片的瞬时表达测定中，在细胞质和细胞核中都检测到FveFDM1-GFP，而FveIDN2-GFP和FveFDM2-GFP仅位于细胞核中（图2E），这与这些蛋白在调节DNA甲基化中的潜在作用一致。
3.3 CRISPR/Cas9敲除FveFDM1导致较小的器官 CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于在FveFDM1中创建更多等位基因，以验证和更好地表征其功能。由于fvefdm1突变位于仅导致最后一个XH结构域截断的第五外显子，为了测试fvefdm2是否为强等位基因，我们选择了两个小的导向RNA（sgRNA），靶向fvefdm1的第一外显子（图3A）。如图3B所示，几个T0转基因系表现出矮化和紧凑的身材，如三个系（fvefdm1CRL1-3）所示。 基因分型分析显示，fvefdm1CR-L3中的sgRNA1靶位点存在大量缺失，sgRNA2靶位点存在1个bp的插入，每条线中存在4个bp的缺失或更复杂的突变（图3C）。与fvefdm1相似，这些品系也发育出较小的叶片（图3，D和E）。fvefdm1CR系的近轴叶表皮相同区域的细胞数量显著减少，细胞大小增加（图3，F和G）。与WT相比，fvefdm1CR幼叶中FveFDM1的表达水平显著降低（图3H），表明这些等位基因遭受无义介导的衰变。总之，这些结果支持FveFDM1是由ros突变定义的基因，并且FveFDM1是FveFDM2的强突变。
3.4 FveFDM1在RdDM途径中起作用，并与FveIDN2直接相互作用 AtFDM1及其同系物通过RdDM途径参与DNA甲基化。为了评估FveFDM1的功能，由组成型启动子35S驱动的其基因的编码序列被稳定地转化为拟南芥中的fdm1-1fdm2-1双突变体，其看起来像WT。总共获得了24个独立的转基因系，所有这些系在外观上似乎都与WT相似。选择了T2代中FveFDM1高表达水平的三个转基因系（L8、L15和L16）（图4A），并通过chop PCR检查了靶位点AtSN1、IGN5和siR02的DNA甲基化水平。 与WT相比，所有基因座显示fdm1-1fdm2-1中的DNA甲基化降低（图4B）。相反，在fdm1-1fdm2-1背景中的三个FveFDM1过表达系在这些基因座上显示出与WT相似的DNA甲基化水平（图4B），这表明FveFDM2也在RdDM介导的DNA甲基中发挥作用。拟南芥FDM1及其同系物在蛋白质复合物中起作用。 为了测试FveFDM1及其假定的同系物是否工作类似，进行了酵母双杂交试验。虽然FveFDM1只能与FveIDN2相互作用，但FveIDN1和FveFDM2分别与家族的其他两个成员形成同源二聚体和异二聚体（图4C）。FveFDM1和FveIDN2之间的异二聚体形成以及FveIDN1的同二聚体也通过分裂荧光素酶互补测定和共免疫沉淀（co-IP）得到证实（图4，D和E）。其他相互作用（FveFDM1-FveFDM2、FveFDM2-FveIDN2和FveFDM2与自身）在荧光素酶测定中不存在，因此在Co-IP中未检测到。然而，这些结果表明FveFDM1也在蛋白质复合物中起作用。
图4 FveFDM1可以恢复拟南芥fdm1-1fdm2-1中的DNA甲基化水平，并与FveIDN2直接相互作用。 A、 通过RT–qPCR检测了FveFDM1在fdm1-1 fdm2-1和三个FveFDM1-ox转基因系（L8、L15和L16）中的表达水平。 B、 WT、fdm1-1和fdm2-1叶片中三个RdDM靶点AtSN1、IGN5和siR02的DNA甲基化水平，以及通过HaeIII或McrBC消化的chop PCR和qPCR检测的三个转基因系。使用未消化的基因组DNA作为每个实施例的对照进行扩增。 C、 通过酵母双杂交试验检测到FveFDM1、FveIDN2和FveFDM2之间的蛋白质相互作用。转化的酵母细胞在SD–Leu–Trp或SD–Leu-Trp–His–Ade培养基上生长。AD，激活域；BD，DNA结合域。空载体用作对照。 D、 通过分裂荧光素酶互补分析在本氏草叶片中检测到FveFDM1和FveIDN2之间的蛋白质相互作用。 E，Co-IP检测到FveFDM1和FveIDN2之间的蛋白质相互作用。 3.5 FveFDM1负责DNA甲基化 为了研究FveFDM1的分子功能，使用三个生物重复的全基因组亚硫酸氢盐测序检测了WT和FveFDM1花蕾中的全局DNA甲基化水平。每个文库的平均测序深度为67.29至80.54，转化率为99.8。与整个基因组的WT相比，fvefdm1中CG和CHG背景下的平均甲基化水平基本保持不变；有趣的是，CHH甲基化大大减少。当我们观察所有基因和转座子元件（TE）的侧翼区域时，相对于WT，fvefdm1中基因侧翼序列的CG和CHG甲基化水平轻度降低（图5A）。相反，CHH甲基化在fvefdm1的所有基因和TE区域几乎完全消除（图5A），这是其他植物物种中RdDM突变体的特征。 为了鉴定受FveFDM1影响的基因座，在FveFDM1和WT之间鉴定了差异甲基化区域（DMRs）（参见“材料和方法”）。因此，根据我们的截止值，共识别出16831个CG DMR、46264个CHG DMR和74749个CHH DMR（CG为50%，CHG为30%，CHH为10%），其中大多数为低DMR（图5B；补充数据集1）。相对于WT，fvefdm1中三种情况下低DMR中的DNA甲基化水平显著降低（图5C）。三种背景下的低DMR主要富集于仅基因区域或同时覆盖基因和TE的区域（图5D），这与RdDM在常色区域中的活性作用一致。更具体地说，三种情况下的低DMR在基因的启动子和下游区域（2kb）中相对更丰富（图5E，补充图S6）。这些结果表明，FveFDM1在最有可能影响基因表达的位置调节DNA甲基化。RdDM活性与24 nt siRNA的生物发生之间存在相互依赖关系。 为了检查siRNA丰度，在用于DNA甲基化分析的相同组织中进行了小RNA测序。每个文库总共获得了257-314万reads，24个nt阅读中的55%可以与F.vesca Ver4基因组唯一对齐。在fvefdm1中，24个nt siRNA是最丰富的类型，其次是21个nt siRNAs，这与WT相似（图5F），表明24个nt的siRNAs的总产量不受fvefdm1的影响，这与其在RdDM途径下游步骤的功能一致。然而，共有23395个siRNA簇（差异表达siRNA簇的83.7%）在fvefdm1中显著下调，而只有4541个siRNA集群（16.3%）上调。与随机siRNA簇相比，下调的siRNA簇与CHH低DMR更密切相关（图5G）。这些数据表明，在FveFDM1介导的DNA低甲基化导致的某些区域，siRNA的生物发生被显著抑制。
通过定量逆转录PCR（RT–qPCR）证实了它们在fvefdm1和WT的茎尖、花朵和幼果中的表达水平（图6D）。在拟南芥中过度表达FveOFP1导致矮化和圆形叶片，支持该基因参与草莓的器官大小和/或形状调节。这三个基因在启动子区域中含有低DMR（补充图S10）。通过chop PCR检测的fvefdm1幼叶中，这些位点的DNA甲基化水平确实降低了（图6E）。一些潜在的重要基因仅在特定组织中差异表达。在fvefdm1果实中上调的基因中，有FveGASA1和FveGASA-2（图6C），它们是FaGAST1和FaGAST2的同源物，过度表达导致果实变小。WUSCHEL-CLAVATA信号模块是茎尖分生组织维持的主要调节器。编码WUS-CLV模块关键成分的小肽基因CLAVAT3（CLV3，FvH4_3g43590）在fvefdm1的茎尖中显著上调（图6C）。一些控制细胞周期的基因在茎尖中下调，包括FveCYCA1、FveCYCA2和FveCDKB1（图6，C和F）。这些细胞周期基因具有低甲基化启动子区（图6G）。赤霉素（GA）是促进草莓果实早期发育以及调节果实形状的关键激素。 在水果中，fvefdm1中四个关键GA生物合成基因FveGA20ox3、FveGA3ox4、FveGA3ox5和FveGA3 ox6的表达显著减少，而GA分解代谢基因FveGA2ox1和FveGA2ox3的表达被诱导（图6，C和H），这表明fvefdm2突变体中可能存在低水平的活性GA。此外，GA分解代谢基因FveGA2ox1和FveGA2ox3具有降低的DNA甲基化水平，并在fvefdm1的花蕾和幼果中上调（图6I，补充图S10）。为了证实这些结果，在fvefdm1CR的幼叶中检查了六个选择的差异表达基因的表达和DNA甲基化水平，显示出与fvefdm1相似的变化（补充图S11）。对RNA-seq和DNA甲基化数据的分析提供了许多在草莓器官大小控制中具有潜在作用的候选基因。
3.6 FveFDM1介导的RdDM通路与GA和生长素相互作用 一些GA和生长素生物合成基因在RNAseq中差异表达，因此检测了WT和fvefdm1幼叶中的GA和生长素含量。因此，与WT组织相比，fvefdm1组织中GA3和2-氧吲哚-3-乙酸（OxIAA）含量丰富，显著减少（图7A），游离IAA趋于减少（P=0.16，Student t检验），表明这两种激素的稳态受fvefdm1调节。此外，对fvefdm1植物进行了GA3的外源施用。处理2周后，WT的叶柄显著拉长，叶片变大（图7，B和C），表明GA是草莓器官大小的正调节因子。 尽管fvefdm1的叶片尺寸也随着GA处理而增加，但fvefdm2的叶柄仍然较短，叶片尺寸小于WT（图7，B和C）。用相同方法处理生长素对叶片大小没有明显影响。GA和生长素都可以在不授粉的情况下促进果托扩大，因此GA3和NAA同时应用于WT和fvefdm1的去雄花1个月。结果，fvefdm1果实因处理而增大，但显著小于WT果实（图7，D和E）。 激素处理结果表明，在器官大小控制中，FveFDM1的突变部分破坏了GA和生长素信号通路。如前所述，GA是草莓叶片大小的正调节因子。为了测试RdDM途径是否受GA调节，在外源性施用GA3 24小时后，通过RT-qPCR检测了WT幼苗（大约六片叶子）中FveFDM1、FveIDN2、Pol-IV亚基FveNRPD1（FvH4_5g01400）和FveDRM2（FvH6_6g50980）的表达水平。这些基因在处理后被极大地诱导（图7F），表明RdDM途径可能被GA激活。此外，fvefdm1、FveCYCA1、FveCYCA2和FveCDKB1中差异表达的细胞周期基因在GA3处理后也显著上调（图7G），进一步证明这些基因的产物可能介导GA诱导的植物生长。
 04 结论 总之，我们假设FveFDM1与其同系物FveIDN2在蛋白质复合物中起作用，该复合物可能直接结合长RNA和AGO4-siRNA，以调节靶位点的DNA甲基化水平（图8）。该模型强调了草莓RdDM途径下游潜在的器官大小调节基因，同时需要进一步的研究来验证其功能。这些数据对于比较研究揭示不同物种间DNA甲基化介导的植物发育的共同调控机制也很有价值.
05 原文获取 原文链接： https://academic./plphys/advance-article-abstract/doi/10.1093/plphys/kiac462/6749584?redirectedFrom=fulltext PDF获取： https://www./h-nd-169.html |
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