 PROTAC（PROteolysis Targeting Chimera）蛋白靶向降解嵌合体，利用细胞中天然存在的蛋白降解机制，即泛素-蛋白酶体系，诱导靶向蛋白降解的一种全新技术。与传统的用于癌症治疗的小分子抑制剂相比，PROTAC有几个潜在优势：其以事件驱动（而非占位驱动-直接抑制靶蛋白功能活性），因此很低的剂量就可以有很好的药效；PROTAC引发蛋白降解后即从复合物中分离，并进入下一个催化循环，药物作用效率高；每个PROTAC可降解很多个蛋白分子，具有突破不可成药靶点的潜力。继2019年PROTAC首次开展临床试验以来，目前，已有18种蛋白降解剂在多个肿瘤类型中开展I期或I/II期临床试验，并于2022年启动了首个III期临床试验。PROTAC的安全性、疗效和药代动力学初始数据正在出炉中，尽管还需要更多的证据支持，PROTAC临床试验数据初显抗肿瘤活性。 最早在2001年提出PROTAC概念的Craig M. Crew教授，2023年2月在Nature Reviews Clinical Oncology上发表一篇综述文章，系统总结了PROTAC开发进展、支持其进入临床阶段的重要临床前研究、人体试验关键数据以及这类新药的未来方向。
癌症的传统治疗方法主要有化疗、放疗和手术治疗。尽管这三种模式仍然是癌症治疗的基石，但放化疗具有毒性、持续不良反应等局限性。小分子抑制剂开创了精准医学的新时代，伊马替尼是世界上首个酪氨酸激酶小分子抑制剂，2001年FDA批准用于BCR–ABL1基因融合慢性髓系白血病。此后，FDA陆续批准了数十种小分子抑制剂，并广泛用于实体瘤和血液病治疗。 尽管小分子抑制剂临床前景广阔，但用于癌症治疗仍有其局限性。一个主要问题是要求靶蛋白有结合口袋，导致85%的靶点难以成药。此外，小分子药物需要足够高的浓度才能够占据靶点的活性位点，并且需要足够长的半衰期持续抑制靶蛋白。长期、高剂量的药物暴露不仅增加不良反应风险，而且导致蓄积毒性。小分子抑制剂的持续治疗导致细胞合成更多的靶蛋白，产生耐药突变或代偿激活。 PROTAC结构及作用机制 泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白降解的主要途径。简而言之，不需要或错误折叠的蛋白会被泛素化标记， 泛素化标记后的蛋白能被26S蛋白酶体识别并降解。泛素化过程通常需要3种泛素化酶的协同作用：E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。其中E3连接酶参与识别待降解蛋白底物。 PROTAC是一种双功能分子，由3部分组成：靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体、中间有一个连接子。PROTAC分子通过其一端的靶蛋白配体特异性识别并结合靶点，通过其另一端的E3泛素连接酶配体特异性识别并结合E3配体。形成靶蛋白-PROTAC-E3连接酶三元复合物，在此复合物中，靶蛋白被E3连接酶泛素化修饰，泛素化修饰后的靶蛋白被蛋白酶体识别并降解，由此抑制靶蛋白功能（图1）。
图1 PROTAC与小分子抑制剂作用机制对比 PROTAC介导E3连接酶和靶蛋白间相互作用，泛素化修饰后的靶蛋白被蛋白酶体识别并降解。小分子抑制剂通过与靶蛋白活性位点或变构位点结合阻断其活性。 PROTAC具有不同于小分子抑制剂的药理学特征 药代动力学不可逆：靶蛋白-PROTAC-E3连接酶三元复合物的形成，其药代动力学不可逆，可以较低浓度促进多个靶蛋白分子的降解。 Hook效应：根据靶蛋白和E3连接酶间的蛋白相互作用，当浓度高时，PROTAC分子会与靶蛋白或E3酶分别形成二元复合，产生HOOK效应（称为“钩子效应”），Hook效应的出现意味着POI和E3配体的独立结合，同时阻止了三元复合物的形成，可能导致严重的副作用。靶向致病蛋白进行降解时，我们的目标是获得较高的最大降解水平(Dmax)（>90%）和低的半数最大降解浓度(DC50)(nM-pM)。 PROTAC结构设计与进展
不可成药靶点：传统意义上的“不可成药蛋白”如KRAS蛋白和STAT3，已成功利用PROTAC降解。PROTAC靶向致癌融合蛋白BCR–ABL1，进一步证明了在不直接结合活性位点的情况下降解蛋白的潜力。 耐药突变：肿瘤靶向治疗过程中通常产生获得性耐药突变，并影响小分子抑制剂的结合。 基因扩增和/或过表达蛋白：针对去势抵抗性前列腺癌（mCRPC），标准治疗是雄激素受体（AR）靶向治疗。对于雄激素水平高、有AR基因或启动子扩增或AR点突变的患者来说，靶向AR的疗法效果较差。因此PROTAC选择降解AR，可阻止AR靶基因的表达和信号传导。 异构体表达蛋白：异构体表达或定位产生获得性功能的致病蛋白，但由于结合位点的高度同源性，用小分子抑制剂具有挑战性。利用PROTAC的降解特异性，可从CDK4/6抑制剂转到选择性开发特异性降解CDK4或CDK6降解剂。 支架蛋白：支架蛋白通过与其他蛋白复合而不是通过自身的催化活性发挥其功能，传统的小分子抑制剂难以直接靶向作用于支架蛋白。 蛋白聚合物：与神经退行性疾病有关，包括阿尔茨海默病和帕金森病，也正在探索PROTAC技术用于这一类疾病的治疗。 E3连接酶配体的选择 人类基因组中有600多种E3连接酶，迄今为止，只有少数E3连接酶被验证或用于PROTAC开发：VHL、CRBN、MDM2和cIAP1。大多数PROTAC使用CRBN或VHL作为E3连接酶配体。 除了CRBN和VHL之外，E3连接酶新配体发现前景广阔。越来越多的研究集中在组织特异性或肿瘤特异性E3连接酶配体的开发上。 靶配体设计 靶向 “不可成药”靶点，需要识别新的靶蛋白配体。DNA编码化合物库（DEL）能较好解决配体筛选及优化困难相关问题。找到潜在配体后，通过连接子将E3泛素连接酶配体和靶蛋白配体组装，进行优化，在保证降解活性的同时，改善水溶度和分子量等理化性质以提高成药性。这样的优化过程通常耗费巨大的成本和时间。 DEL+PROTAC可充分发挥DNA编码化合物库技术筛选小分子化合物的高通量优势，从而发现可以调控E3连接酶活性和靶蛋白水平的高潜力小分子化合物，针对同一个E3连接酶或靶点蛋白，DEL技术平台可以进行多次平行筛选，解决同一E3连接酶可能存在的不同构象的问题。 2021报道了一项利用DEL发现新雌激素受体-α（ERα）配体的初步研究，这些配体随后被转化为活性蛋白降解剂。DEL技术还可能用于发现新的分子胶降解剂、E3连接酶配体和全蛋白降解剂。 连接子设计 连接子(linker)同样是PROTACs中重要的组成部分。目前报道的PROTAC分子中，Linker的选择以聚乙二醇和烷基链为主。连接子过短会影响总体构象和结合方向，不利于三元复合物的形成；连接子太长则可能会破坏三元复合物形成正协同效应。 可通过降低自由能或限制生物活性构象设计连接子，进一步增强效力。这一策略已用于SMARCA2/4降解剂、AR降解剂研究，并在ER降解剂ARV-471中应用。 结构辅助设计 基于结构生物学合理设计蛋白降解剂仍处于起步阶段。无论X射线晶体学、低温电子显微镜还是建模，都很难获得对蛋白质降解作用机制至关重要的三元复合物的3D结构图像。一项里程碑意义的研究中，靶蛋白BRD4-PROTAC MZ1-E3连接酶配体VHL X射线晶体结构，显示了三元界面中广泛的蛋白-蛋质接触，驱动三元复合物协同作用，连接子参与蛋白-配体相互作用，并解释了对BRD家族的特异性降解机制。 药代动力学 口服给药是疾病治疗的理想给药形式，但是PROTAC分子本质上是双靶点药物，独特的结构导致分子量较大，溶解性较差，药物性质很难满足经典的Lipinski类药五原则。并且其体内外渗透性表现不佳，口服生物利用度通常偏低，吸收较差。 根据已有报道，优化PROTAC有望达到足够的口服吸收水平。然而，少数研究数据发现，烷基和PEG连接子线性脂肪链或醚结构有被氧化代谢的风险，大大减少了药物暴露浓度和时间，加快PROTAC分子排出体外。设计构象约束的定制接头可降低代谢风险和/或增强口服吸收，例如引入增溶基团碱性胺。 临床前证据
图2 PROTAC开发关键进展时间轴 关键的临床前研究数据如下： AR靶向蛋白降解剂 靶向雄激素受体（AR）的五种PROTAC（Bavdegalutamide（也称为ARV-110）、CC-94676、AC176、HP518和ARV-766）正在转移性前列腺癌中开展临床试验。已在学术会议上报道过ARV-110临床前数据，而其它AR降解剂的数据迄今尚未披露，此文不作讨论。 Bavdegalutamide是一款靶向AR的PROTAC蛋白降解剂，通过将E3泛素连接酶募集到AR附近，给AR加上泛素标签，引导其被蛋白酶体降解。 在各种前列腺癌动物模型中测试了Bavdegalutamide的降解活性。去势和非去势抵抗小鼠中，口服Bavdegalutamide对肿瘤生长的抑制作用明显大于恩扎鲁胺，表达AR人源肿瘤异种移植模型（PDX）中，Bavdegalutamide对肿瘤生长有100%的抑制作用，且PSA水平降低>90%。 ER靶向蛋白降解剂 雌激素受体（ER）阳性乳腺癌是最常见的乳腺癌亚型，内分泌治疗是ER阳性晚期乳腺癌一线治疗方案，常与CDK4/6抑制剂联用。氟维司群（Fulvestrant）是一种新型的ER拮抗剂，能促进降解和下调ER，而接受氟维司群治疗后高达50%患者ER仍处于基线水平。此外，内分泌治疗期间，患者可能发生ESR1基因突变，导致对氟维司群等ER降解剂的敏感性降低。为解决氟维司群作为ER降解剂的不足，两种靶向ER的PROTAC（ARV-471和AC682）正在临床开发，用于ER阳性乳腺癌。 乳腺癌细胞系临床前分析中，ARV-471诱导野生型ER降解，DC50 1-2 nM；携带ER耐药突变（Y537S和D538G）的细胞系也在暴露于ARV-471后降解。此外，ARV-471在ER阳性乳腺癌模型中也显示了令人鼓舞的抗肿瘤活性。在雌激素依赖的原位MCF7异种移植模型中，ARV-471以10 mg/kg或30 mg/kg每日一次，肿瘤生长抑制率>90%（有证据表明肿瘤消退，即在30 mg/kg剂量下，肿瘤抑制率>100%），同时肿瘤ER水平降低>90%。 BTK靶向蛋白降解剂 BTK是B细胞受体（BCR）信号转导通路中的关键激酶，参与B细胞增殖、分化与凋亡过程。已有多种BTK小分子抑制剂（如伊布替尼）获批或在开展临床试验，用于B细胞恶性肿瘤治疗，而耐药突变是所有共价型BTK抑制剂的痛点。针对这一痛点，目前有4种靶向BTK的PTOTAC（NX-2127、NX-5948、BGB-16673和HSK29116）在临床开发用于B细胞恶性肿瘤患者。NX-2127和NX-5948的临床前数据已披露，但BGB-16673和HSK29116研究结果尚未知。 NX-2127可诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和套细胞淋巴瘤（MCL）BTK野生型细胞系中BTK降解；此外，BTK-C481S突变的细胞系对BTK抑制剂耐药，而NX-2127可有效抑制耐药细胞增殖。NX-2127可高效降解BTK蛋白，抑制细胞增殖能力比BTK抑制剂更强。RNA测序发现NX-2127下调了参与DNA复制和修复、细胞周期和生存信号通路相关基因的表达。此外，NX-2127上调CD1c表达，CD1c参与T细胞对癌细胞的识别。 BRD9靶向蛋白降解剂 BRD9是ncBAF复合物的一个亚基，该复合物还包括致癌融合蛋白SS18-SSX，该蛋白与滑膜肉瘤发生有关。两种靶向BRD9的PROTAC CFT8634和FHD-609用于晚期滑膜肉瘤患者的效果正在评估。 CFT8634 是具有口服活性的 BRD9 蛋白降解剂，该分子的抑制活性水平达到纳摩尔 (DC50=3 nM)。该药物已被 FDA 授予治疗滑膜肉瘤的孤儿药资格。CFT8634剂量范围为1-50 mg/kg，每日一次，在两种不同的滑膜肉瘤PDX模型中诱导强烈的肿瘤生长抑制。在其中一个PDX模型中，CFT8634治疗结束后肿瘤持续消退。 靶向其他蛋白的PROTAC DT2216将VHL作为E3泛素连接酶配体，靶向抗凋亡蛋白BCL-xL，目前处于I期临床试验阶段。 KT-413（以前称为KTX-120）将CRBN作为E3泛素连接酶配体，靶向IRAK4，该蛋白参与Toll样受体下游的信号传导，IRAK4是参与机体先天性免疫反应的关键分子。 KT-333是靶向转录调节因子STAT3的蛋白降解剂，STAT3是重要的转录因子，参与多种生物学功能，包括细胞增殖、存活、凋亡和炎症。KT-333在实体瘤细胞系、淋巴瘤细胞系和原代免疫细胞中诱导STAT3的有效降解。 ASP3082是一种靶向KRAS G12D的蛋白降解剂，KRAS G12D通过有丝分裂原激活的蛋白激酶通路调节细胞增殖和存活，该通路与多种实体瘤有关，包括胰腺癌、肺癌和结直肠癌。ASP3082在胰腺癌细胞中诱导KRAS G12D有效降解。 CFT1946是靶向BRAF V600X突变的选择性蛋白降解药物，该突变常见于黑色素瘤、结直肠癌和肺癌。 PROTAC关键的临床证据
Bavdegalutamide临床数据 根据I/II期ARDENT临床试验(NCT03888612)数据，新型雄激素受体PROTAC降解剂bavdegalutamide在既往接受过1-2种新型激素药物治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者中具有临床活性，且可耐受、不良反应(AE)可控。 46%携带AR T878X/H875Y突变的患者(n=28)，前列腺特异性抗原(PSA)下降50%或更多(PSA50)；57%的患者PSA下降30%或更多(PSA30)。值得注意的是，不携带这些突变的患者中，PSA下降至少50%。 I期研究的一个关键发现是生物标志物定义的患者亚组，Bavdegalutamide活性更高；5例既往接受过AR拮抗剂治疗并携带AR T878和/或H875突变的患者，血清PSA下降≥50%（PSA50）的最佳率为40%。基于临床前和早期临床数据，设计了II期扩大（ARDENT）队列研究，包括AR T878A/S和/或H875Y；野生型AR或AR改变，T878A/S、H875Y、L702H、AR-V7和AR L702H或AR-V7除外（包括同时发生的T878X/H875Y）。这些患者既往因去势敏感性疾病和CRPC接受过1-2种激素药物和至少1种既往化疗。还有一个临床定义的生物标志物无关的亚组，即既往接受过1种新型激素药物但既往未接受过化疗的既往治疗较少的患者。 至2021年12月20日，共入组195例患者（I期71名，II期124名）。I期/II期共有152例患者进行生物标志物和PSA评估，PSA50率为17%，最佳PSA下降率≥30%（PSA30）为31%。总之，这些数据证明了Bavdegalutamide在mCRPC患者中的临床活性，其中许多患者接受了多线治疗，并且所有患者既往AR拮抗剂治疗后疾病均进展。此外，该研究表明mCRPC在与耐药性相关的AR突变中可能仍然严重依赖AR；AR 878/875阳性肿瘤患者可能是对Bavdegalutamide特别敏感的人群。 在I期和II期接受治疗的138名患者中，超过20%的患者报告了TRAE，包括恶心（48%）、疲劳（36%）、呕吐（26%）、食欲下降（25%）和腹泻（20%）。TRAEs一般为1级或2级，无4级或更高事件，且很少导致Bavdegalutamide剂量减少（8%的患者）或治疗中断（9%）。这些结果证实了早期I期数据分析中所见的耐受性概况，没有证据表明Bavdegalutamide的脱靶效应。Bavdegalutamide在mCRPC患者中的进一步研究正在进行中。 ARV-471临床数据 PROTAC ER降解剂ARV-471在局部晚期或转移性ER+HER2−乳腺癌患者I/II期临床试验（NCT04072952）的早期数据，证实了蛋白降解剂的临床活性。I期剂量递增阶段，ARV-471在不同剂量水平下耐受性良好。在30mg-700mg所有剂量水平都观察到了高水平的ER降解（89%），并且其具有良好的耐受性；无论ESR1是否突变，均可降解ER。在47名可评估的患者中，临床获益率(CBR；确认完全或部分缓解或稳定的疾病≥24周的比率)为40%(95%CI：26-56)。 II期队列扩展部分（VERITAC）正在评估ARV-471两种剂量（200 mg和500 mg每日一次）的疗效及安全性。截至2022年6月6日，71例晚期ER+HER2−乳腺癌患者口服ARV-471治疗，患者既往接受过四种其他治疗（100%既往接受过CDK4/6抑制剂，79%接受过fulvestrant治疗，73%接受过化疗（在转移情况下为45%））。200mg剂量35例可评估患者的临床获益率为37.1%（95% CI 21-55%） 和500mg剂量下36例可评估患者的临床获益率为38.9%（95% CI 23-57%）。ESR1突变患者，19例可评估、200mg给药剂量的临床获益率为47.4%（95% CI 24-71%），20例可评估、500mg给药剂量的临床获益率为54.5%（95% CI 32–76%）。两例患者（每个剂量组一例）部分缓解。基于良好的疗效和耐受性、稳定的ER降解活性（I期/II期研究中，可评估患者中位数为69%，范围为28–95%），选择200mg、每日一次作为ARV-471 III期单药治疗给药剂量，并在一项随机III期临床试验（NCT05654623），对比ARV-471和氟维司群治疗的疗效，拟入组患者为既往接受过CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗的晚期ER+HER2−乳腺癌患者。 NX-2127临床数据 BTK降解剂NX-2127I期研究，首次报告了36例复发和/或难治性B细胞恶性肿瘤患者（其中23例慢性淋巴细胞白血病（CLL））的数据，口服100 毫克，200 mg或300 mg NX-2127，每日一次，数据截止日期为2022年9月21日。总体人群中既往接受过4线治疗（CLL亚组为5线），86%的患者既往接受过BTK抑制剂（CLL子组为100%），35%的患者BTK抑制剂耐药突变（CLL组为48%））。20%以上的患者报告的TEAE为疲劳（53%）、中性粒细胞减少（39%）、血小板减少（25%）、高血压（25%）和贫血（22%）。中位随访5.6个月（范围0.3-15.7）后，23例CLL患者中有14例继续接受NX-2127治疗；在15例可评估的CLL患者中，客观有效率为33%（95%CI 12–62%）。NX-2127100mg剂量，每日一次治疗 CLL患者BTK水平持续下降，血浆CCL4水平下降，CCL4是B细胞活化标志物。无论BKT是否突变，NX-2127均可降解BTK并具有临床活性。 蛋白质降解剂的未来方向 进入临床试验阶段的PROTAC分子主要以传统的AR、ER、BTK等为靶点，这些蛋白分别与前列腺癌、乳腺癌和慢性淋巴细胞白血病发病相关，并且已获批的药物可作为临床前和临床试验的基准。Bavdegalutamide、ARV-471和NX-2127显示了PROTAC用于癌症治疗的活性，其他药物必将紧随其后，下一步的关键是确定该方法是否符合临床上对PROTAC的期望，即用于经典不可治疗靶标的降解。针对复发和/或难治性淋巴瘤和晚期实体瘤患者的STAT3降解剂KT-333和针对晚期KRAS G12D突变实体瘤患者的ASP3082I期临床研究数据有望给出答案。 药物递送系统也可以成为一种有效的替代策略，通过将PROTAC包装到递送载体中，将其快速输送到疾病部位。这些递送系统可以最大限度地减少与生物系统的非特异性相互作用，通过减少不需要的组织积累来减少副作用，并在患病部位时空可控释放PROTAC以实现其功能。目前已报道了多种靶向递送系统，可以在肿瘤中被光笼、叶酸受体或活性氧选择性激活。此外，尽管本综述侧重于PROTAC用于癌症治疗，但该技术可能也可靶向其他疾病相关蛋白（例如，自身免疫性疾病相关IRAK4），从而提供广阔的治疗潜力。 蛋白质降解靶向嵌合体潜在挑战 患者是否会对PROTAC产生耐药，尚未有临床数据支持。到目前为止，大多数PROTAC耐药的实例都是通过影响泛素-蛋白酶体系统，例如E2泛素连接酶、E3泛素连接酶的成分或E3连接酶活性的调节蛋白（如COP9信号小体）功能丧失，而不是靶蛋白的改变。一项临床前研究发现通过上调药物外排泵MDR1产生耐药，表明联合MDR1抑制剂有助于克服耐药。需要持续对接受PROTAC治疗的患者进行监测评估，以确认临床中是否存在临床前耐药机制。 针对其他靶点和癌症类型设计新型蛋白降解剂也是该技术需要突破的局限，包括要求其同时进入细胞内泛素-蛋白酶体与目标蛋白结合。此外，尽管靶向经典不可降解蛋白是一个非常有趣和有潜力的领域，但不应低估识别降解剂结合位点的困难。蛋白质降解剂的DEL等技术以及与蛋白质降解剂互补的技术可能会克服这些障碍。 过去的二十年，PROTAC真正经历了从实验室研究到应用于临床实践(Bench to Bedside)的艰苦跋涉。迄今为止，实验室研究占据了这段旅程的大部分时间，包括体外和体内系统设计、改进和严格的临床前试验。仅在4年前进入临床开发阶段，初步的临床数据表明PROTAC用于癌症治疗的效果令人鼓舞和欣慰；我们热切期待更多来自PROTAC的临床研究数据，并为治疗其他疾病提供巨大的前景。 参考资料 Chirnomas D, Hornberger KR, Crews CM. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2023 Feb 13. doi: 10.1038/s41571-023-00736-3. Epub ahead of print. PMID: 36781982.
|
|
|
