Detroit R&D 柠檬酸盐合酶测定解决方案

位于线粒体基质的柠檬酸合成酶是线粒体中的限速酶柠檬酸循环（或克雷布斯循环）的第一步。柠檬酸合成酶催化乙酰辅酶A和草酰乙酸的乙酸残基形成柠檬酸盐。醋酸氧苄酯在完成一轮克雷布斯循环后再生。酶活性用于评估线粒体的氧化能力以及线粒体的完整性。

柠檬酸合成酶可以通过以下方式测量从CoA-SH释放的-SH基团的形成使用反应性埃尔曼试剂（5,5'-二硫代双[2-硝基苯甲酸]，DTNB）并监测吸光度在412纳米处。

Detroit R&D 柠檬酸盐合酶测定组分如下： 

·96孔板。

·提取缓冲液。

·反应缓冲液。

·DTNB混合。

·乙酰辅酶A

·氧卤乙酸盐混合物

样品制备：

·硬组织：在刀式匀浆器（Polytron、Turrax或快速超声处理）中以每克组织4毫升提取缓冲液的比例，并在4°C下以1000克离心15分钟。收集上清液，测量蛋白质（最佳浓度约为0.5 mg/ml）。

·细胞：在Potter Elvehjem中超声或均质。在4°C下以1000g离心10分钟，收集上清液，测量蛋白质（准确浓度约为0.5mg/ml）。

·富含线粒体的部分：由于92%的柠檬酸合成酶活性位于线粒体和乙酰辅酶A不能穿透其中，可以通过分离线粒体来制备（提高产量）并将其分解。用线粒体匀浆对样品进行匀浆缓冲液（250mM蔗糖、2mM乙二胺四乙酸（EDTA）和25mM Tris-HCl，pH 7.4）加蛋白酶抑制剂。在4ºC下以800g离心10分钟。仔细收集上清液（丢弃颗粒），并在4ºC下以15.000-20.000 x g离心20分钟。通过添加清洗颗粒PBS，离心15.000-20.000 x g，离心5分钟。用提取缓冲液重新悬浮颗粒。

试剂制备：

·解冻所有试剂。

·在DTNB混合管中加入985µl反应缓冲液（在冰上稳定一天）。

含量测定（415 nm，37℃）：

· 20ml样品（总蛋白质范围5-20µg/ml）

·10µl反应缓冲液

· 5 m乙酰辅酶A的l

· 15ml样品缓冲液

·增加100ml至板材坯料

·混合10秒，在37ºC下孵育1分钟。

·增加50ml草酰乙酸盐混合物，快速混合5秒，在3-8分钟内读取。

反应空白-添加提取缓冲液代替反应缓冲液中的样品以及乙酰辅酶A和草酰乙酸混合样品（除ELISA板空白外）应从样品中扣除该活性价值观

Detroit R&D 柠檬酸盐合酶测定文献引用：

[1] PA Srere.Citrate synthase.Methods Enzymol., 13:3-11, 1969.

[2] D Shepherd & PB Garland.Citrate synthase from rat liver. Methods Enzymol., 13:11-16, 1969.

[3] E Bogin & A Wallace.Citrate synthase from lemon fruit. Methods Enzymol., 13:19-22, 1969.

[4] J. Santos et al. Free Radical Biology and Medicine 51: 1849-1860, 2011