手把手教您做酵母双杂筛库（质粒转化法）

Y2HGold-GAL4系统酵母双杂筛库（质粒转化法）

产品简介

目前，酵母双杂筛库实验有多种方案，本公司根据多年经验，总结出一个较优Y2HGold-GAL4系统酵母双杂筛库方案，分为四个步骤：重组诱饵载体的自激活、毒性检测和表达，制备Y2HGold[pGBKT7-Bait]感受态与筛选cDNA文库，筛选阳性克隆，互作克隆鉴定。本方案还分析了阳性克隆的复筛和两种形式AD载体的回转验证。

产品组成

注：

1. 本试剂盒可供一次酵母筛库。

2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80 ℃保存。

3. 0.5 L×3代表：3个包装，每个包装0.5 L；5×1 mL代表：1个包装，含5个1 mL。

4. 按照本试剂盒的流程操作，可以在最大程度上节约时间。

5. 对照菌株的最佳AbA浓度参考网站菌株说明书。

实验方法

酵母双杂交筛库常用的三种方法：

1.将构建好的诱饵质粒和文库质粒共转化到同一种酵母菌株（Y2HGold或AH109）。

2.先将构建好的诱饵质粒转化到酵母菌株（Y2HGold或AH109），制备成感受态后再将文库质粒转入。

3.将诱饵载体转化到MATa型酵母（Y2HGold或AH109），文库质粒转化到MATα型酵母（Y187），两种酵母通过mating进行筛库试验。

Y2HGold酵母菌含有AUR1-C基因，该基因具有AbA抗性，AbA具有强效杀死酵母的作用。如果蛋白质之间进行了互作，就会激活该基因的转录，下游报告基因AUR1-C就会表达，使得酵母菌可在含有AbA抗生素的培养基上生长。而没有发生蛋白质互作的酵母菌则不能生长，这就大大减少了筛库时的背景，因此我们更推荐使用Y2HGold-GAL4筛库系统。三种筛库方法并没有明显的优劣之分，可以根据实验条件和习惯进行选择，本方案是第二种方法。

一、实验耗材和试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1.灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm培养皿，备用。

2.Carrier DNA在95-100 ℃水浴5 min，然后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3.稀释金担子素：取100 μL AbA（1 mg/mL）于900 μL无水乙醇中稀释，充分混匀，即AbA浓度为100 μg/mL，4 ℃冰箱中备用（稀释10倍后使用有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释）。

4. 普通平板制备：

将1条培养基倒入0.5 L去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min）。液体培养基4 ℃保存备用；固体培养基，按照20-25 mL/块（Φ90 mm）或者70-75 mL/块（Φ150 mm）倒平板，凝固后放入4 ℃冰箱保存。

5. 特殊平板制备：

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（X-α-gal）：将一条SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar培养基溶于500 mL去离子水，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，每25 mL固体培养基加入25-50 μL X-α-gal母液，倒平板25 mL/块（Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（AbA+X-α-gal）：将一条SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar培养基溶于500 mL去离子水，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，每20 mL固体培养基加入20-40 μL X-α-gal母液，稀释后的金担子素（AbA）参考表1加入，倒平板20 mL/块（Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。

表1 不同AbA浓度平板

二、菌株使用及保存

1.挑取一环甘油保存的菌液（约10-50 μL）于SD/-Leu/-Trp平板上划线，28-30 ℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。

2.挑取上述单菌落于SD/-Leu/-Trp液体培养基中，200 r/min、28-30 ℃振荡培养2 d，OD600应大于1，取1 mL菌液集菌，弃上清，加入0.2 mL 15%甘油，-80 ℃可长期保存。

三、实验步骤

酵母双杂筛库实验方案较多，本公司根据多年经验，对质粒转化法筛库进行了优化。本方案在诱饵载体和文库载体构建已完成的基础上进行撰写，分为四个步骤：

1. 重组诱饵载体的自激活、毒性检测和表达；

2. 制备Y2HGold[pGBKT7-Bait]感受态与筛选cDNA文库；

3. 筛选阳性克隆；

4. 互作克隆鉴定。

3.1重组诱饵载体的自激活、毒性检测和表达

3.1.1 诱饵转化酵母Y2HGold感受态细胞

1.取100 µL冰上融化的Y2HGold感受态细胞（货号：CC309），依次加入预冷的质粒pGBKT7（2-5 µg，约5 μL），pGADT7（2-5 µg，约5 μL），Carrier DNA（95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次）10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2.将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3.5000 rpm离心40 s，弃上清，ddH2O 400 µL重悬，5000 rpm离心30 s，弃上清。

4.ddH2O 50 µL重悬，涂布于SD/-Leu/-Trp平板，30 ℃培养48-96 h。

按表1 将各质粒转入酵母Y2HGold感受态细胞，观察检测结果。

表2 酵母转化反应

注：Y2HGold[pGBKT7-Bait+pGADT7]和Y2HGold[pGBKT7-Bait]都可用于自激活检测。

3.1.2 重组诱饵载体的自激活检测（筛选诱饵酵母菌株的AbA最佳使用浓度）

1.阳性对照为两个互作的蛋白，表达载体为pGBKT7-53和pGADT7-T，阴性对照为两个没有互作的蛋白，表达载体为pGBKT7-Lam和pGADT7-T。

注：本试剂盒含有阳性和阴性对照菌株，于SD/-Leu/-Trp平板划线活化即可。

2.阴性Y2Hgold[pGBKT7-Lam+pGADT7-T]和阳性Y2Hgold[pGBKT7-53+pGADT7-T]对照菌株已转化完成，所以自激活实验组菌株选择Y2HGold[pGBKT7-Bait+pGADT7]，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3 mm）于1 mL 0.9%氯化钠溶液中重悬，OD600调至0.002（也可以用SD/-Leu/-Trp液体培养基培养至OD600=0.002），然后取100 μL涂板SD/-Leu/-Trp，SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal和SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA这三种固体选择培养基上。

3.将培养皿置于30 ℃恒温培养箱中培养3-5 d，直至长出克隆。

4.观察诱饵酵母在不同AbA浓度平板上的生长状况，确定AbA*最佳使用浓度。

注：在不同SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上（0，100 ng/mL，200 ng/mL，300 ng/mL，500 ng/mL，700 ng/mL，1000 ng/mL），出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为AbA最佳使用浓度（最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度）。一般情况下筛库自激活AbA浓度不宜超过800 ng/mL。

3.1.3 重组诱饵载体的毒性检测

1.实验组为Y2HGold[pGBKT7-Bait]，对照组为Y2HGold[pGBKT7]，OD600调至0.002，然后取100 μL分别涂板SD/-Trp固体选择培养基。

2.将培养皿置于30 ℃恒温培养箱中培养3-5 d，直至长出克隆。如果诱饵具有毒性，含诱饵载体的菌株比转化空载体的克隆要小的多。

3.挑取克隆到SD/-Trp液体培养基，30 ℃振荡培养，于不同时间取培养菌液测OD600值，观察酵母菌的生长速度。如果诱饵蛋白的表达对酵母有毒性，那么酵母在液体和固体培养基中都会生长的很慢。30 ℃，200 rpm振荡培养15 h，测OD600值，若差异小则诱饵蛋白对Y2HGold菌株无毒性，差异大则有毒性。

注：酵母杂交实验，不适于毒性很强的蛋白。

3.1.4 酵母菌表达蛋白的提取（SK2440-50T）

1.配置裂解储液：8 M尿素，5%的SDS，40 mM的Tris-HCl（pH6.8)，0.1 mM的EDTA-Na2，0.01 mM的溴酚蓝。用时在1 mL的裂解储液加入10 μL的β-疏基乙醇和50 μL的100×PMSF。

2.将Y2HGold[pGBKT7-Bait]酵母克隆在SD/-Trp液体培养基中悬浮，然后在30 ℃，250 rpm条件下振荡培养，直到OD600值达到0.6-1。离心后每7.5 OD600单位的菌体加入100 μL的裂解液。

3.裂解液中最初含有过量的PMSF，但随着时间推移也会迅速降解，对蛋白样品进行操作15 min之后，补加等量的100×PMSF，此后每过7 min加一次，每100 μL裂解液加入1 μL的100×PMSF 。

4.每7.5 OD600单位的菌体加入80 μL酸洗玻璃珠，剧烈振荡l min。然后70 ℃水浴10 min。

5.将样品在4 ℃下，12,000 rpm离心5 min，转移上清至新的离心管中，置于冰上。

6.所得沉淀在100 ℃煮沸3-5 min后，剧烈振荡1 min，然后在4 ℃下，12000 rpm离心5 min。所得上清与步骤5所得上清合并。

7.将蛋白提取液煮沸3-5 min，可立即用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测，或者-80℃保存备用。

3.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.制备12%的聚丙烯酰胺分离胶两块，每块15 mL，所需各种试剂为：去离子水4.9 mL，30%丙烯酰胺溶液6 mL，1.5 M Tris-HCl (pH8.8) 3.8 mL，10%SDS 0.15 mL，10%过硫酸铵0.15 mL，TEMED 6 μL。配好后混匀，立即向玻璃板之间注入4/5的分离胶。上部加入l cm高的去离子水压平胶面，放置40 min。

2.待分离胶聚合好后，倒去分离胶表面的去离子水，并用滤纸将剩余的水分吸干，然后配置5%浓缩胶5 mL，所需试剂为：去离子水3.4 mL，30%丙烯酰胺溶液0.83 mL，0.5 M Tris-HCl (pH6.8) 0.63 mL，10% SDS 0.05mL，10%过硫酸铵0.05 mL，TEMED 5μL。配好后混匀，并注入分离胶上面。插入点样梳，放置20 min。

3.待浓缩胶聚合好后，向电泳槽中加入电泳缓冲液并小心拔去点样梳。

4.将所提取的蛋白样品和Marker分别进行100 ℃水浴5 min，取出后立即置于冰浴中冷却。离心后取上清20-30 μL加入点样孔。

5.电泳使用恒流程序，起始电流为每块胶10 mA，待样品跑出浓缩胶后改为每块胶20 mA至电泳结束。

6.一块胶用考马斯亮蓝方法染色，一块胶进行western blot。

3.1.6 Western blot

1.转膜：将凝胶在转移缓冲液（192 mM甘氨酸，25 mM Tris，20%甲醇）中漂洗30 min。剪1张和胶大小一致的硝酸纤维素膜和8张滤纸，放在去离子水中5 min排净表面空气，然后浸泡于转移缓冲液中20 min。

2.在转移夹子一侧放一块泡沫垫，泡沫垫上放4张滤纸，然后将硝酸纤维素膜置于滤纸上对齐，凝胶置于膜上，在凝胶上方再放置4张滤纸，在滤纸上再放一块泡沫，上述操作每一步都需要严格对齐并排出气泡。合上转移夹子并放入转移电泳槽中，凝胶对着电泳槽的负极，加入适量转移缓冲液，恒流120 mA转移3 h。

3.封闭：电转结束后，用去离子水冲洗，并用TBST(氯化钠9 g，Tris 12.1 g，Tween-20 500 μL，加去离子水至1 L)漂洗硝酸纤维素膜，然后转入含有5%脱脂奶粉的封闭液中，4 ℃封闭过夜。

4.一抗反应：倒掉封闭液，TBST冲洗3次，每次10 min。重新配置封闭液，并1:1000的比例加入c-Myc单克隆抗体，37 ℃下轻轻摇晃孵育2 h。

5.二抗反应：将膜用TBST漂洗3次，每次10 min。然后加入用TBST稀释2000倍的HRP标记的山羊抗鼠单克隆抗体，37 ℃下轻轻摇晃孵育l h。

6.显色反应：将膜用TBST漂洗3次，每次10 min。利用DAB显色试剂盒（货号SK2020）进行显色，室温避光反应3-8 min直至显色。

注：酵母杂交实验不适于在酵母中无法表达的蛋白。

3.2 制备Y2HGold[pGBKT7-Bait]感受态与筛选cDNA文库

1.（选做步骤）挑取生长较快（大）Y2Hgold[pGBKT7-Bait]酵母单菌落在SD/-Trp培养基平板上划线，30 ℃培养2-4天。

2.待酵母单菌落直径长至2 mm时，把酵母菌接种到3 mL液体SD/-Trp培养基中，30 ℃过夜培养。

3.第二天转接到含有50 mL液体YPDA（或SD/-Trp）培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000 rpm离心5 min，弃上清。

4.用10 mL Y1溶液重悬沉淀，3000 rpm离心5 min，弃上清。

5.加入0.6-1 mL Y2溶液重悬，分装于1.5 mL无菌冻存管，转文库按600 μL分装，转质粒按100 μL分装，可直接用于转化。

注：制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。具体操作是将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，置于-80 ℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80 ℃冰箱，可保存一年。使用前室温融化后用于转化。

6.取上述Y2HGold[pGBKT7-Bait]感受态细胞600 µL于冰上，依次加入预冷的15 μg cDNA文库质粒（约30 μL）、2520 μL Y3溶液，轻柔吸打混匀，30 ℃水浴 90 min (10 min时翻转1次混匀)。对于部分菌种，延长孵育时间可提高转化效率，但不要超过3小时。

注：文库质粒加入量与文库质量有关，可根据实际情况加入。建议用ddH2O补充体积，将质粒与Y3溶液的体积定容为2.6 mL。

7.（可选步骤）3000 rpm离心5 min，弃上清。用3 mL YPD Plus Liquid Medium重悬沉淀，30 ℃摇床振荡培养90 min。

8.3000 rpm离心5 min，弃上清。加入12-15 mL 0.9%氯化钠溶液重悬菌体，涂布于筛选培养基平板。

注：上述为酵母大规模转化，将文库质粒转化进诱饵酵母菌株中；同时做小规模转化将pGADT7-T和pGBKT7-Lam共转Y2HGold，pGADT7-T和pGBKT7-p53共转Y2HGold作为阴、阳对照。本试剂盒已包含阳性对照菌，在相应的培养基上划线培养即可。

9.取出50 μL进行梯度稀释，浓度分别为1/10，1/100，1/1000，1/10000，然后每个浓度取100 μL分别涂布在SD/-Trp，SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp三种不同的选择培养基上(Φ90 mm培养皿)，然后30℃培养3-5d。这一步必须做，目的是计算筛库的所有克隆数。

10.剩余重悬菌体（12-15 mL），每200 μL涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA*选择培养基上(Φ150 mm培养皿)，一般需要涂50-55个培养皿，然后30℃培养3-5 d。

11.克隆长出后，需要查清步聚9中各个培养皿内的克隆数，以此来计算筛选文库的克隆数目和筛库效率。

注：

a.总共12 mL，每板可以适当增加重悬菌体量，减少平板数量（30块），建议50-55块平板（Φ150 mm）。与自激活浓度相比，筛库平板AbA*浓度应高出50 ng/mL。

b.SD/-Leu/-Trp平板上，至少要有1.0×106个克隆，如果克隆数较少，会降低筛选到阳性克隆的概率。SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上，克隆数非常少往往与诱饵序列和文库质量有关。有研究表明30万个克隆也能筛选到阳性克隆。

c.30 ℃培养3-5 d，统计SD/-Leu/-Trp (Φ90 mm)平板上单菌落数目，计算文库筛选克隆数。文库筛选克隆数=[cfu/mL on SD/-Leu/-Trp]×[稀释倍数]×[重悬体积(15 mL)]

转化效率=克隆细胞数×悬浮体积（mL）×稀释倍数×[涂板体积（mL）×总DNA的量（μg）]-1

3.3筛选阳性克隆

1. 活化阳性菌株

（可选步骤）将所得的蓝色克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA*固体选择培养基上划线培养，以此纯化互作克隆（也可以在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA*板上挑取蓝色克隆重复划线，直至无白色菌落）。30 ℃培养，2-4 d内长出的菌落可用于后续验证。

注：此步骤选做。与下面的3.复筛鉴定互作酵母菌株有重复。是否加入AbA，根据诱饵自激活情况而定。

2. 菌落PCR鉴定互作酵母菌株

选择直径约为2~3 mm的克隆，菌落PCR扩增，引物为pGADT7-F/R，PCR体系和程序参见酵母阳性克隆快速检测试剂盒（货号：SK2420）。

3. 复筛鉴定互作酵母菌株

电泳条带大于400 bp（根据实验目的和实际情况而定）的单菌落，划线于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培养基上，30 ℃培养2-4 d。有多条电泳条带的单菌落（含有多个质粒的转化子），需要在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA*筛选培养基上重复划线培养2-3代，然后通过菌落PCR的方法选出具有单个质粒的克隆。

3.4互作克隆鉴定

互作克隆鉴定也称点对点互作验证或回转验证。在回转验证实验中，AD载体有两种形式，文库质粒或互作基因CDS片段重新构建pGADT7质粒，都可以用于验证实验。可以参考本公司的Y2HGold双杂互作验证试剂盒，这里仅做简要描述。

以互作基因CDS片段重新构建pGADT7质粒为例，进行点对点互作验证。将上述PCR产物送公司测序，使用BLAST序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，通过NCBI在线Blast分析互作基因CDS片段，然后设计引物，以cDNA为模板（建库时的cDNA），PCR扩增互作基因CDS片段（Prey），双酶切重新构建pGADT7载体，并转化Y2HGold[pGBKT7-Bait]菌株。

1.用SD/-Leu/-Trp液体培养基摇阳性酵母克隆菌株，离心收集菌体并提取文库质粒。如果阳性克隆超过60个，方法参见PE056 96孔一步法酵母质粒小提试剂盒（用于PCR/大肠杆菌转化）；如果阳性克隆少于60个，方法参见PE055 一步法酵母质粒小提试剂盒。

2.从酵母中提取的文库质粒转入E.coli感受态细胞，转化液全部涂布在含Amp的LB培养基上，37 ℃培养16 h。每个样品取3-5个克隆（重复）进行菌液PCR鉴定。

3.挑取鉴定成功的单菌落摇菌，提取大肠杆菌中的文库质粒，方法参见**公司的质粒小提试剂盒说明书。

4.使用BLAST序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，通过NCBI在线Blast分析互作基因CDS，然后根据其对应的引物，以cDNA为模板（建库时的cDNA），扩增互作基因CDS全长，重新构建pGADT7载体。

5.互作转化反应如表2，AD-Prey转入Y2HGold[pGBKT7-Bait]为实验组，对照组1可以更好的体现实验组是否互作，对照组2可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略。对照组3为反向验证。

表2 酵母转化反应

6.质粒转化诱饵菌株，快速离心转化液，0.9%的氯化钠溶液分别悬浮转化菌体，涂布SD/-Leu/-Trp培养基上，30 ℃培养3-5 d。

7.取转化后的重组子菌落，重悬于0.9%的氯化钠溶液中，将OD600调至0.2、0.02、0.002、0.0002。分别取100 μL菌悬液涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基，30 ℃倒置培养2-4天，观察菌落生长情况，如表3 表4。

注：上述为涂板法验证酵母杂交互作，梯度稀释点板法可参考本公司的Y2HGold双杂互作验证试剂盒。

8.将转化后的重组子酵母进行PCR、测序、比对分析（或提取质粒、PCR、测序、比对分析），方法同上。

表3 阳性

表4 假阳性

四、总结

目前，常使用的酵母双杂筛库系统有三种Y2HGold-GAL4系统（质粒转化法）、AH109-GAL4系统（质粒转化法）和GAL4系统（mating法），前面两个筛库系统都有两种筛库方法，如上文所述。不同的筛库系统和筛库方法并没有明显的优劣之分，可以根据实验条件和习惯进行选择。如果筛库阳性克隆较大，结合96孔一步法酵母质粒小提试剂盒，可以快速批量的验证单杂阳性克隆。本方案还分析了阳性克隆的复筛和两种形式AD载体的回转验证。更多问题解答，可联系本公司.

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