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随着基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）商用微生物鉴定系统的批准和临床应用，标志着这种革命性技术日渐成熟。质谱鉴定技术因具有速度快、通量大、结果准确、操作简单以及运行成本低等诸多优点，而迅速席卷全球，逐步成为很多大医院临床微生物鉴定的首选方法。除了可以对培养后的菌落进行鉴定外；MALDI-TOF MS还可以对阳性报警的血培养液与胸腹腔积液、脑脊液、尿液等无菌体液标本进行直接鉴定，显著减少了这类标本培养鉴定的时间，从而提高感染性疾病的诊疗效率；另外，MALDI-TOF MS在耐药表型分析、致病因子及毒素检测等方面也显示出明显的优势。笔者在质谱鉴定技术临床应用中总结了一些心得体会，现分享如下： 1. 要分清是否为混合感染：即便使用了良好的培养基，两种或多种细菌混合生长时，也难以获得单一菌落，即使高分辨率的质谱仪也不能识别菌落融合的细菌。此时，应涂片镜检判断是否为混合菌感染，混合感染的标本需对菌落进行分纯培养后再鉴定。 2. 注意培养时间对鉴定结果的影响：培养时间应遵守厂家推荐的范围（一般18-24小时），幼稚菌落利用MALDI-TOF MS鉴定也能获得理想的结果；但对常见的需氧菌来说，使用培养时间超过72小时的菌落进行鉴定会影响鉴定分值及准确性。 3. 低分值结果的处理： （1）有些细菌因其细胞壁、荚膜以及分泌到胞外的蛋白质等结构的差异，致蛋白质析出不充分，会影响鉴定分值，常见于丝状真菌、肺炎链球菌、诺卡菌等。这类细菌鉴定前，“破壁”是非常重要，可用用磁珠加上合适比例的甲酸和乙腈结合旋涡震荡充分乳化和碾磨其细胞壁；再用超声波超声破碎细胞，这样可有利于蛋白质的完全析出，通过这样富集提取的蛋白纯度和产量较高，可提高鉴定分值和结果的准确性。 （2）黏液状细菌的处理，由于细胞外的荚膜蛋白成分（黏液部分）可能干扰到对胞内蛋白的分析而导致鉴定失败，可用无菌棉签抹去菌落表面的黏液成分，再进行挑取菌落。而对某些难以涂布的菌落，可以先将菌落混入于基质液中，再使用悬浮液进行涂板。在涂板时，为了避免单个靶孔涂布失败，可以选择同一菌落同时涂布2~3个靶孔，提高成功率和鉴定分值。 （3）有些情况下，鉴定分值偏低甚至低于1.7，但如果数据库出现连续三个相同的菌名，即使分值偏低仍视为可用。另外，有时可能遇到优质的质谱图却未得到结果的现象，这时需要改用其他方法鉴定。 4. 对近缘菌的再鉴定：在MALDI-TOF MS的应用中，我们会发现高度疑似志贺菌的菌落，但利用MALDI-TOF MS鉴定得到的结果却总是大肠埃希菌，这是为什么呢？MALDI-TOF MS作为一种蛋白指纹图谱识别技术，并非对特定的蛋白质进行鉴定，而是对单个微生物的总体蛋白构成进行分析，所以一些特定的近缘种之间通过MALDI-TOF是不能区分的，志贺菌与大肠埃希菌，肺炎链球菌与唾液链球菌等都属于这种情况。这时候需要一些补充试验来获得决定性的鉴定结果，如Optochin纸片法、显色筛选培养基和血清凝集试验等。 5. 抗酸杆菌的鉴定，传统上，结核分枝杆菌及非典型分枝杆菌一般都是通过抗酸染色、罗氏培养基或PCR等方法进行鉴定，存在周期过长、阳性率低等问题。较少有医院开展全面的结核分枝杆菌分离鉴定。但是，MALDI-TOF MS可快速对可疑结核分枝杆菌菌落进行鉴定，大大缩短了确诊时间。现在普遍的方法是将培养物接种到快速液体结核分枝杆菌增菌液中，报阳后，将抗酸染色阳性的增菌液转种至罗氏培养基上培养，待菌落生长后进行质谱鉴定。分枝杆菌的质谱鉴定需要重视的是生物安全防范，可用进口无水乙醇混匀菌落放置2小时灭活后再进行后续鉴定，该过程必须在生物安全达到2级以上的实验室（BSL-2）进行，其他处理同普通细菌鉴定。 6. 对尿路感染的尿液标本，需注意： ①可先用尿液分析仪如UF-1000i初步判断细菌含量，小于104/mL时很难鉴定； ②标本应即送即检，避免保存过久引起杂菌生长干扰鉴定结果； ③标本含两种以上细菌时，需作分离培养后再进行鉴定。 7. 靶板清洗：靶板清洗没有固定要求，但时间间隔不宜过长，以免菌落悬液痕迹难以清除，实验室可根据标本检测量灵活掌握清洗间隔。 步骤：去离子水浸泡30分钟；甲酸浸泡30分钟；乙腈浸泡30分钟；擦镜纸轻擦表面；去离子水冲洗2次；无水乙醇冲洗，晾干。 可以说质谱技术是未来微生物学实验室鉴定的主流技术，在未来5〜8年内仍保持技术层面的先进性。未来 MALDI-TOF MS 的发展重心将是数据库的不断扩充与完善，特定软件的研发与优化，我们微生物实验室MALDI-TOF MS的使用者应该在应用中不断总结分析，以推动MALDI-TOF MS的研究朝着简便化、标准化、自动化等方向发展，使其能够精准及时地为临床用药提供有力支持。 参考文献 [1]管明秀,张文成,王宝占,崔喆,等.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在肿瘤诊断及微生物鉴定中的应用[J].实用医药杂志,2020,37(12):1133-1137. [2]左瑞菊.质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用[J].医学食疗与健康,2020,18(21):180-181. [3]许荣琴,杜鸿,谢小芳,郭敏,周惠琴.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在尿标本微生物快速鉴定中的应用[J].检验医学与临床,2018,15(24):3694-3697. [4]王成彬.质谱技术临床实验室应用[J].中华检验医学杂志,2019,42(06):395-398. [5]Tsuchida Sachio， Umemura Hiroshi ， Nakayama Tomohiro. Current Status of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in Clinical Diagnostic Microbiology.[J]. Molecules (Basel, Switzerland), 2020, 25(20) : 4775-4775. [6]Wang Yueling etal. Rapid method for direct identification of positive blood cultures by MALDI -TOF MS.[J]. Experimental and therapeutic medicine, 2020, 20(6) : 235-235. 文章作者： 高州市人民医院检验科 陈泽城 编辑：伟 |
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