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基因的变异类型有多种（点击查看），对应的分子检测方法亦有多种，当前资本市场驱动着分子检测市场，并极力追捧NGS技术，因为其通量高，灵敏度高且性价比高。小编承认NGS是分子检测的必然发展趋势，但是短时间内，NGS并不会取代其他分子检测方法，因为针对不同的需求，都有对应的理想检测方法，每个检测平台都有着自己的优势，比如： 操作简单：PCR，ARMS-PCR，HRM等 时间快速：ARMS-PCR，HRM等 成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等 准确：Sanger等 通量高：NGS等 灵活性：Pyrosequencing等 结果分析简单：ARMS-PCR等 自动化：核酸提取等 ...... 小编一直认为：没有最好的技术，只有最合适的技术！最好的，不一定是最合适的；最合适的，才是真正最好的。 今天，我们聊一聊PCR电泳技术。首先，我们先了解什么是PCR技术？ PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）,一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 1983年美国Kary Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生，1993年Kary Mullis因发明PCR方法获得诺贝尔化学奖。  Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry (1993) PCR的原理：PCR的基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于与靶序列两端互补的Oligo引物。整个过程由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成： 1，模板DNA变性：模板或经PCR扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后，双链之间氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，以便它与引物结合，为下一轮反应做准备。 2，模板DNA与引物的退火（复性）：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度（55℃左右）时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3，引物的延伸（72℃）：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为原料，按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补的链。 重复上述 变性-退火-延伸 的循环过程，每一循环获得的“半保留复制链”都可成为下次循环的模板。通常每完成一个循环需时为2~4min，2~3h就能将靶核酸扩增放大上亿倍（30个循环时，靶产物数量约为10亿）。（注：PCR的第1和第2个循环，并没有短的目的片段，只是在第3个循环后才有，并且有部分双链的长片段将始终伴随整个扩增过程）  PCR的扩增原理 PCR电泳法应用实例介绍 比如现在有一名高血压患者，我现在要做高血压个性化用药基因检测（点击查看），拟选择卡托普利进行降压，那么需要对ACE I/D突变进行检测。经过引物设计（点击查看），最终的野生型目的片段约在200bp左右，由于突变型的目的片段比野生型的多了287bp的插入，那么突变型的片段约在500bp左右。  ACE I/D 16号内含子中存在的287bp插入 DNA经过PCR的扩增后，我们对扩增的产物进行电泳检测，DNA凝胶电泳所需的标准琼脂糖浓度一般为1.0%。浓度越高，小条带的分辨率越高；反之，琼脂糖浓度越低，大分子量条带的分辨率和分离程度越高。 在电场中，中性pH值缓冲液（TAE/TBE）下DNA都带净负电荷并向凝胶装置正极(+)方向移动（下图中，上为“-极”至下为“+极”），DNA分子越大则所受阻力越大，也越难在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢，比如500bp的DNA分子比200bp的DNA分子迁移就慢。 此外，电泳时需要将DNA与荧光染料混匀，结合染料后，DNA会在紫外灯下发出荧光，这样才会出现下图中的亮色条带，常用的染料有EB（溴化乙啶）、gel red、sybrgreen1等（有钱建议不要用EB，因为有毒）。 在电泳结束后进行结果解读，我们无法直接判断DNA的长度，所以需要在电泳过程将DNA产物与DNA标准品（DNA Marker）一起跑电泳，DNA Marker里面含有若干种长度已知的DNA（下图中出现6条亮带的就是DNA Marker），通过与之比较可以粗略判断DNA样品的长度。同时DNA Marker中的DNA片段浓度已知，通过与DNA Marker的亮度进行比较也能初步判断DNA样品的浓度。 结果解读：通过与DNA Marker比较，如果是野生型，那么就是左边这个图，可发现DNA片段长度大小约为200bp，如果是突变型，那么就是右边这个图，突变有纯合突变和杂合突变两种，中间一条500bp的条带即为纯合突变，最右边的200bp及500bp两条条带即为杂合突变，通过PCR及简单的电泳法便可准确的进行ACE I/D的检测。  ACE I/D电泳结果 整个实验主要操作步骤  PCR电泳技术点评 优点： 1，操作简单； 2，时间较快； 3，实验设备比较普及； 4，成本低。 缺点： 1，通量低； 2，检测局限性； 3，部分结果不容易判断。 此方法适宜于硬性条件不好的实验室进行低通量的分子检测。 |
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