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【1001问】问题268:黏液染色应注意哪些问题?

 xiaorui 2023-04-21 发布于江苏

黏液染色应注意哪些问题?
黏液染色的注意事项:
1.黏液染色的组织固定很重要,一般采用酸性或中性甲醛,乙醇,特别是FineFIX也可作为最好的黏液固定剂,但不可使用碱性甲醛,作异染反应最好采用含汞的固定剂。
2.升汞固定液是蛋白质的良好固定剂,由于其对糖类及黏液物质无固定作用,亦无破坏作用,所以,对于染色剂与黏液物质的着色有很好的促进作用。最好标本在升汞溶液中固定 (不需加入氯化钠或乙酸),固定后不必水洗,亦不必用碘乙醇作后处理,可直接投入纯乙醇急速硬化。石蜡包埋或火棉胶包埋。
3.在硫堇染色液配制方面,也可采用如下配制:蒸馏水5ml,加入热硫堇饱和水溶液2滴。
4.切片封固前需用不掉丝的吸水纸吸干切片,待切片彻底干后,再用二甲苯等透明剂透明,如切片不完全透明可用吸水纸吸干二甲苯后再重入新二甲苯透明,直至切片完全透明为止再封固。
5.使用阿新蓝试剂是要注意,阿新蓝是一种水溶性氰化亚太铜盐,染色可能是盐与酸基键结合,其确切的化学结构仍不清楚。阿新蓝是显示酸性黏液物质最特异的染料,这种阳离子染料与酸性基团形成盐键,利用染液的不同pH及不同的电解质浓度,就可以区分酸性黏液物质的类属。电解质如氯化镁在阿新蓝染液中与阿新蓝竞争酸性黏液物质的反应成分,氯化镁为0.06mol/L时羧酸化和硫酸化黏液物质染色;0.3mol/L以上只有硫酸化黏液物质染色。阿新蓝在pH为1和2.5时可区分酸性黏多糖、硫酸黏多糖和糖蛋白,在pH为1时羧基 (-COOH)不能离子化因而不能着色,但硫酸基 (-OSO3 H)却可被显示;在pH为2.5时羧基染色良好而硫酸黏液却着染不佳。
(1)染色原理进一步证实阿新蓝与组织内含有的阴离子基团、羧基及硫酸根形成不溶性复合物,即染料分子中带正电荷的盐碱和酸性黏液物质中带负电荷的酸性基团结合而成蓝色,所以,阿新蓝可用于区分羧基黏液物质与硫酸化黏液物质。
(2)对购入的阿新蓝染料应以熟知的对照片进行染色试验,这些切片应做黏液染色深度检验和非特异性背景着色检验,各批染料的差别很大,甚至有的染料质量极劣,不能使用。
(3)阿新蓝在pH 2.5时对含羧基的黏液物质染色很好,而对硫酸基的酸性黏液物质则染色不佳,当pH为1.0时含羧基的黏液物质不着色,而含硫酸基的黏液物质染色较佳。
(4)采用不同电解质浓度的阿新蓝法时:
①氯化镁低浓度溶液背景淡蓝色。
②阿新蓝一定要符合下列要求:一应为8GX(不是8GS或5GS或7GS),二要保持新鲜,出厂不超过三年;三是溶解度要大,水溶液至少要达到5%;四是1%阿新蓝在2mol/L氯化镁以0.025mol/L乙酸缓冲液 (pH 5~7)混合后在24小时内不应沉淀。
③组织切片至少染色4小时,过夜效果更好。
④背景可稍着色,尤其在低浓度溶液中染色时。
6.过碘酸的时间必须维持在最少的时间,室温下不得超过15~20分钟;绝不能加温,因为这会发生化学变化,PAS技术的特异性取决于它的较短的氧化时间,在过碘酸内滞留时间较长 (7~24小时)会使蛋白质和酸性黏多糖也变得与PAS试剂发生反应,从而使中性黏液的显示被淹没。
7.碱性复红染色液的配制是关键,配制时应先将碱性复红与乙醇充分溶解,然后加入浓盐酸和三聚乙醛室温下放置2天,待溶液变蓝紫色,于冰箱中保存。染色时从冰箱中取出复温后使用。
8.阿新黄的着色力较强,如果染色时间过长或染色液配制浓度过高,都有可能掩盖阿新蓝的染色效果,所以在配制染色液时要十分严格,染色当中的时间控制也要严格掌握。同时,阿新黄GXS是一种单偶氮染料,在pH为2.5时水溶液同样可染唾液酸黏液。
9.渗析铁溶液实验室配制法,将氯化铁75g逐渐溶于250ml蒸馏水中,加入甘油100ml,不断搅动逐渐加入28%氨水55ml,此溶液在定期更换蒸馏水下渗析3天。
(1)促染液需临用前配制。
(2)配制的胶体铁染色原液为深棕红色,较稳定,可较长时间保存。
(3)但在染色时应临用前配制染色液,染色液使用不得超过2天。
10.醛品红染色液配制时,将碱性复红充分溶于乙醇中,再加入盐酸,和三聚乙醛室温下放置2天,待溶液变蓝紫色后,于冰箱中保存。醛品红染色液配成后,一般用3天,数周后仍有染色能力,但非原来的性质,陈旧染液需延长染色时间。

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