前沿文献 | 肿瘤固有YTHDF11通过促进MHC-I降解，驱动免疫逃避和免疫治疗抵抗

研究背景

RNA甲基化在调节免疫细胞浸润肿瘤对免疫治疗反应有潜在的影响。m6A抑制剂，特别是FTO抑制剂，包括Dac51、FB23、FB23-2、CS1、CS2和甲氯芬酸，已被开发用于癌症治疗，并在临床前试验中显示出很大的希望。YTHDF11可能是最有活力的m6A解读蛋白，目前很少有可能的YTHDF11治疗拮抗剂。

研究方法

研究结果

一、YTHDF11过表达与“免疫沙漠”表型和对免疫检查点抑制剂的抗性有关。

TCGA数据集YTHDF11 RNA与免疫评分呈最明显的负相关，暗示其可能在调节免疫逃避中发挥作用 (图1A)。基因集富集分析(ssGSEA)分析发现，YTHDF11低的样本显示出显著水平的免疫细胞浸润，表明它们具有免疫炎症表型，而YTHDF11高的样本具有较低水平的免疫细胞浸润，表明它们具有“免疫沙漠”表型(补充图1B)。

YTHDF11的表达与CD8A、CD8B、GZMA、GZMB和TNFRSF18的表达以及活化的CD8 T细胞评分呈负相关(图1B, C)。免疫荧光验证了48个黑色素瘤组织芯片YTHDF11蛋白表达(红色)和CD8 t细胞浸润(绿色)，在YTHDF11蛋白表达低组的CD8 表达较低(图1D)。

Fig1

接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者的两个队列(GSE78220和GSE91061)RNA-seq数据中发现YTHDF11在进展性疾病(PD)中过表达。肿瘤免疫功能障碍和排斥 (TIDE)方法评估TCGA-SKCM数据集发现高YTHDF11表达与免疫治疗耐药有关。在抗PD-L1和抗CTLA-4抗体存在下发现YTHDF11在耐药B16/F10肿瘤中显著上调 (图1J)。

 生存分析显示在GSE65904 SKCM数据集中，高YTHDF11表达与预后不良相关 (图1K)。在TCGA-SKCM数据集中，YTHDF11在TGFB1低组中具有显著的预后价值。

Fig1

二、肿瘤细胞通常使用内在调节剂来逃避免疫监视。

使用CRISPR/Cas9基因编辑系统在B16/ F10细胞系中敲除YTHDF11基因。通过(i)细胞计数;(ii)CCK8;(iii)克隆形成试验和(iv) EdU研究YTHDF11在体外细胞增殖功能试验。然而，YTHDF11-KO B16/F10细胞与野生型(WT)细胞在增殖和活力方面没有差异(Supplementary Fig. 3G-J)。YTHDF11缺陷显著抑制了免疫功能正常小鼠的肿瘤发生，YTHDF11 - ko组的肿瘤体积(图2A)、肿瘤重量(图2B)和发光强度(图2C, D)更小，存活时间(图2E)更有利。类似的结果在肺转移模型中得到了验证(图2F-H)。提示肿瘤固有的YTHDF11的致癌功能参与了抗肿瘤免疫。

Fig2

三、免疫功能正常小鼠中YTHDF11-KO和WT肿瘤组织之间的转录组分析显示编码细胞毒性分子的基因(如Gzmb、Gzmf、Prf1、Cd8a和Cd8b1)表达增强。富集分析显示，免疫相关途径在YTHDF11-KO肿瘤中上调(图3B)。流式细胞术分析显示肿瘤浸润性CD4 和CD8 T细胞水平升高(图3D)，通过免疫组织化学染色进一步可见(补充图4C, D)。

Fig3

大部分白细胞介素家族和趋化因子家族在YTHDF11-KO肿瘤组织中上调 (图3E)，且细胞因子蛋白水平上调 (图3F)。结果表明，肿瘤固有的YTHDF11缺陷通过触发免疫抑制肿瘤生长。

YTHDF11-KO (n = 3)和WT (n = 3)肿瘤的浸润CD45 免疫细胞进行了单细胞转录组分析(图4A)。从6个肿瘤样本中共获得29325个CD45 免疫细胞谱，10个免疫细胞群。YTHDF11-KO肿瘤中T细胞、NK细胞和增殖混合免疫细胞富集，而WT肿瘤中中性粒细胞和B细胞浸润较高 (图4D)。

对CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞和B细胞进行了亚组分析。CD4 亚群的比例和细胞数量不同(图4F)。在YTHDF11-KO肿瘤中，CD4 T细胞由初始CD4 T细胞组成下降(图4G)。KEGG富集分析显示，免疫相关途径在TEMs、Tregs、增殖性CD4 T细胞和ifn应答性CD4 T细胞中上调，但在naïve CD4 T细胞中下调 (图4H)。流式细胞术证实，来自YTHDF11-KO组的肿瘤浸润性CD4 T细胞表现出强烈的IFN-γ和颗粒酶B的产生(图4I)。更重要的是，通过伴随的T细胞受体(TCR)测序，确定CD4 TCR克隆型扩增在YTHDF11-KO肿瘤中增加 (图4J, K)，并且主要分布在功能性CD4 T细胞而非初始细胞中 (图4L)，表明正在进行的免疫应答。

Fig4

在CD8 T细胞亚群分析中，YTHDF11-KO肿瘤表现出更多的CD8 T细胞浸润 (图5B)。KEGG富集分析显示，在CD8 TEXs、IFNresponsive CD8 T细胞和增殖性CD8 T细胞中，一组免疫相关通路 (如抗原加工和递呈、趋化因子信号通路和T细胞受体信号通路)上调，表现出激活的效应状态 (图5C)。这些结果表明，KO组中增殖的CD8 T细胞和CD8 TEM亚型比WT组具有更强的免疫功能。

Fig5

流式细胞术和在TCR测序分析在YTHDF11-KO肿瘤中，CD8 TCR多样性降低，克隆型扩增升高(图5G, H)，并且在TEX中高度分布，表明抗肿瘤特异性反应 (图5I)。

鉴于CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中的关键功能，接下来通过给药抗小鼠CD8单克隆抗体(mab)在体内耗尽CD8 T细胞，发现CD8 细胞的缺失在很大程度上挽救了YTHDF11-KO肿瘤的生长(图5J)。

总体而言，单细胞测序分析显示，肿瘤固有的YTHDF11缺陷通过TME重塑促进了抗肿瘤免疫细胞的浸润，减少了促肿瘤免疫细胞。

Fig5

四、肿瘤固有的YTHDF11缺陷增强了体内对ICI治疗的反应。在小鼠模型中探索了YTHDF11缺乏是否能提高ICI治疗的疗效。首先比较了WT组和KO组的免疫检查点分子。在肿瘤细胞中，缺乏YTHDF11增加了体内PD-L1的表达，但在体外没有 (图6A)。KO组中PD1 或CTLA4 CD8 T细胞富集 (Fig6B)，结果表明，YTHDF11缺乏可能与ICI治疗协同产生强大的抗肿瘤作用。抗PD-L1或抗CTLA-4抗体在YTHDF11KO的小鼠中显著减少肿瘤体积 (图6C)。

Fig6

五、肿瘤固有YTHDF11缺陷通过限制溶酶体对MHC-I的蛋白水解来促进免疫原性。蛋白质组学研究B16/F10 WT组 (n = 5)和KO组 (n = 5)，功能富集分析显示，在KO组中，溶酶体是下调的最显著的途径 (图7B)。进一步多组学分析鉴定了YTHDF11 m6A靶点；(ii)通过核糖体分析测序 (Ribo-seq)评估YTHDF11对其靶点翻译的影响。溶酶体基因被鉴定为YTHDF11靶向和m6a标记的转录本，然后是减弱的翻译 (图7C)。结果表明YTHDF11缺乏阻碍了溶酶体基因的翻译，最终降低了蛋白质的表达，阻碍了溶酶体的产生。流式细胞术和透射电镜进一步证实了YTHDF11-KO组中溶酶体的减弱 (图7D, E)。

Fig7

分析发现KO组肿瘤细胞表面MHC-I的表达明显上调 (图7F)。此外，WT组巴菲霉素A1 (BafA1)或氯喹 (CQ)对溶酶体的药理学抑制可以模拟KO组MHC-I的上调 (图7F)。

为了进一步测试WT和KO细胞的免疫原性，先用WT和YTHDF11-KO组产生的全肿瘤抗原(WTA)免疫小鼠，然后在15天后用B16/F10细胞攻击小鼠。结果表明，YTHDF11 KO细胞的WTA引发具有强大的抗肿瘤作用，肿瘤体积减小，存活率提高，免疫细胞浸润增加(图7H-L)。表明YTHDF11缺失抑制肿瘤抗原和MHC-I降解，最终增强肿瘤识别，恢复肿瘤免疫监视。

Fig7

六、外泌体介导的YTHDF11耗竭通过恢复体内抗肿瘤免疫减缓肿瘤进展。通过一种外泌体介导的CRISPR/Cas9递送系统，在体内靶向致癌基因YTHDF11 (图8A)。从TME中纯化天然外泌体，将靶向YTHDF11基因 (KO外泌体)的CRISPR/Cas9质粒或对照载体 (载体外泌体)装载到外泌体中。天然外泌体、KO外泌体和载体外泌体采用透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒流式细胞术和western blotting进行表征，显示出有效的肿瘤靶向性 (图8F)。

Fig8

总结：该论文先进技术带领研究深入，不仅结合了转录组测序、单细胞测序，还通过通路分析和实验验证了细胞互作通路，再结合TCR测序以及蛋白组学分析探索下游调控蛋白，包括体内、体外实验验证了表达与细胞表型、耐药与免疫干预、生存预后的关联，最后还加上了外泌体这一热点，构建了靶向肿瘤的特异性药物。推荐大家去看原文！

参考文献：

Tumor-intrinsic YTHDF1 drives immune evasion and resistance to immune checkpoint inhibitors via promoting MHC-I degradation. Nat Commun. 2023 Jan 17;14(1):265. doi: 10.1038/s41467-022-35710-7. PMID: 36650153; PMCID: PMC9845301.