|
前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）作为胆固醇代谢的关键分子，在其外源摄取中发挥重要的调节作用。目前已有两种PCSK9抑制剂Evolocumab和Alirocumab被批准用于临床治疗高脂血病。2020年11月11日，杜克大学Chuan-Yuan Li教授课题组在 Nature上发表了题为“Inhibition of PCSK9 potentiates immune checkpoint therapy for cancer”的文章[1]。文章中指出抑制PCSK9可通过不依赖胆固醇代谢通路的机制，来提高免疫细胞的瘤内浸润和肿瘤细胞表面MHC-I类分子的水平，拓宽了PCSK9抑制剂的应用领域。 ——生物学背景—— 以PD-1，CTLA-4为代表的免疫检查点疗法虽然在特定肿瘤中展现出良好的疗效，如黑色素瘤、非小细胞肺癌以及肾癌等，然而其对70%的癌症患者疗效甚微，且伴随着严重的免疫相关不良反应，亟需探寻新的肿瘤免疫靶点或治疗策略来提高肿瘤免疫疗效。其实作者将胆固醇代谢与肿瘤免疫联系起来绝非偶然，早在2016年就有学者在Nature上指出抑制ACAT1胆固醇酯化酶可以通过促进T细胞抗原受体的聚集，以及免疫突触的成熟来增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性[2]；也有研究报道，降低血液胆固醇水平可以提高过继T细胞的疗效[3]；细胞膜中的胆固醇也被证明在MHC-I类分子的循环过程中起到关键作用[4]。基于上述前人的研究成果及PCSK9在调控胆固醇代谢中的重要性，作者猜想，PCSK9或许也参与到调节抗肿瘤免疫的过程中，便以此为基础开展了后续研究。 ——实验结果—— 研究伊始，作者使用CRISPR-Cas9技术在4种恶性小鼠癌细胞系4T1、B16F10、CT26、MC38中敲除PCSK9基因来探究其对肿瘤生长速率的影响。结果发现，PCSK9的敲除并不会改变肿瘤细胞在体外的形态或生长速率，但将其分别接种小鼠后，与对照组相比，成瘤能力明显减弱（图1a-h）。
图1. PCSK9基因敲除的4T1，B16F10，CT26，MC38肿瘤分别接种到Balb/c或C57BL/6小鼠后的肿瘤大小（a,c,e,g）和存活率（b,d,f,h）。 为探究PCSK9敲除对肿瘤生长的抑制与免疫系统间的关联，作者将PCSK9 KO的肿瘤细胞分别接种到两种免疫缺陷小鼠NCG，Rag1-/-中，发现其对两种小鼠的肿瘤生长均无抑制能力，暗示该抑制过程涉及到免疫系统的协助。此外，作者也通过对LDLR进行knock down证明该过程不依赖于胆固醇代谢通路。 在此基础上，作者评估了抑制PCSK9对肿瘤免疫疗法的影响。首先，作者在四种小鼠肿瘤模型中均发现PCSK9的敲除与PD-1抗体能协同抑制肿瘤生长（图2a-f）。随后，作者使用临床上已被批准用于治疗高脂血症的两种PCSK9抗体Evolocumab或Alirocumab对MC38荷瘤小鼠进行处理后也观察到类似的结果（图2g-i）。
图2. a,d,g.PCSK9敲除（a,d）或PCSK9抗体（g）与PD-1抗体对小鼠肿瘤模型进行联合治疗的具体方法。b,e,h为对应的肿瘤生长曲线。c,f,i为对应的小鼠存活率。 为深入阐明抑制PCSK9增强抗肿瘤免疫效应的具体机制，作者采用流式技术对PCSK9 KO的B16F10肿瘤浸润免疫效应细胞进行定量分析。实验结果表明PCSK9 KO的肿瘤细胞，其浸润的CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞的数量显著增加。相比之下，CD4+ Foxp3+ regulatory T细胞（Treg）的数量无显著增加（图3a-e）。为探究不同免疫效应细胞在PCSK9 KO介导的肿瘤抑制过程中的相对重要性，作者使用基于抗体的策略去分别耗竭上述免疫效应细胞。结果如图3i和3j所示，CD8+T细胞的耗竭完全消除了PCSK9 KO所致的肿瘤生长抑制，而其他免疫细胞的耗竭无显著影响，说明CD8+T细胞在该过程中起到了决定性的作用。
图3. a-e.Control或PCSK9 KO的B16F10荷瘤小鼠，每mg肿瘤组织中各种免疫效应细胞的流式定量分析结果。i,j. PCSK9 KO的B16F10肿瘤细胞接种CD8+T细胞耗竭的C57BL/6小鼠后的肿瘤生长曲线（i）和小鼠存活率（j） 在文章的最后，作者揭示了PCSK9 KO的肿瘤细胞调控CD8+T细胞杀伤能力的分子机制。由于PCSK9可通过与LDLR蛋白互作并将其重定向到溶酶体中进行降解来下调LDLR蛋白水平，所以作者提出假设，即PCSK9能否通过类似的方式直接调控MHC-I的水平呢？作者构建了小鼠PCSK9及MHC-I（H2-K1）各种缺失或截断的突变体（图4a）。IP实验结果（图4b）表明，PCSK9羧基端的M2结构域缺失后，完全丧失与MHC-I的结合能力。而MHC-I α1中68-70位氨基酸的缺失，会导致其与PCSK9的结合能力完全丧失。为证明上述PCSK9和MHC-I的互作结构域，在肿瘤免疫功能发挥中的重要性，作者分别用M2结构域缺失的PCSK9或68-70位氨基酸缺失的MHC-I做回补实验，结果表明二者均不能抑制B16F10荷瘤小鼠的肿瘤生长，证明了上述结构域在PCSK9介导抗肿瘤免疫中的重要性。
图4. a.鼠源PCSK9蛋白结构，信号肽（SP）:1-34；前体结构域（Pro）：34-155；催化结构域（Catalytic）155-453；C末端结构域（CRD）：453-594。b.FLAG标记的H2-K1与HA标记的全长PCSK9或各种缺失突变体共转进293T细胞后的IP结果。 免疫荧光共染的实验结果表明，在PCSK9过表达的细胞中，MHC-I更多的定位在溶酶体中，较少定位在细胞膜上。而在PCSK9 KO的细胞中则反之（图5h）。对其细胞裂解物的western blot也再次证实免疫荧光共染的结果。即在溶酶体中，过表达PCSK9导致MHC-I蛋白含量升高，敲除PCSK9会使之下降（图5i，j）。在使用环己酰亚胺（抑制细胞内合成新的蛋白）处理不同时间后，与对照组相比，PCSK9敲除的MDA-MB-231细胞中HLA-ABC水平下降的更慢（图5k）。当用bafilomycin A1抑制溶酶体功能后，HLA-ABC在对照组中的水平显著增加，而在PCSK KO的细胞中变化不大（图5l），因此上述结果共同表明PCSK9通过溶酶体介导的降解途径来调节HLA-ABC水平。
图5. h.荧光共聚焦显微镜展示了过表达或敲除PCSK9的B16F10细胞中MHC-I（H2K1-FLAG）的分布。比例尺，10微米。i，J.western blot检测过表达或敲除PCSK9的B16F10细胞中，溶酶体（i）或细胞膜（J）的H2K1-FLAG水平。k，l.分别用cycloheximide(CHX, k) 或bafilomycin A1 (BafA1, l）处理对照组及PCSK9 KO MDA-MB-231后，western blot检测细胞中HLA-ABC的水平 ——小结—— 本文发现抑制肿瘤细胞的PCSK9可通过提高其表面MHC-I的水平来增强免疫检查点抑制剂的疗效，该过程不依赖于胆固醇代谢途径，且可使肿瘤浸润免疫效应细胞的数量和多样性显著增加。具体机制为PCSK9与MHC-I直接互作并以溶酶体介导的方式来下调肿瘤细胞表面MHC-I分子的水平，阻断其在细胞表面的循环利用。此外，作者还阐明了PCSK9与MHC-I的互作界面，即PCSK9的M2结构域与MHC-I分子68-70位氨基酸直接互作，为相应的小分子抑制剂或多肽药物设计提供理论指导。 参考文献： [1]. Liu, Xinjian , et al. "Inhibition of PCSK9 potentiates immune checkpoint therapy for cancer." Nature (2020). DOI: 10.1038/s41586-020-2911-7 [2]. Yang, Wei , et al. "Potentiating the antitumour response of CD8+ T cells by modulating cholesterol metabolism."Nature (2016). DOI: 10.1038/nature17412 [3]. Ma, X. et al. "Cholesterol negatively regulates IL-9-producing CD8+ T cell differentiation and antitumoractivity." J. Exp. Med (2018). DOI: 10.1084/jem.20171576 [4]. Naslavsky, N , et al. "Characterization of a nonclathrin endocytic pathway: membrane cargo and lipid requirements." Mol. Biol. Cell (2004). DOI: 10.1091/mbc.e04-02-0151 作者：郭 超
|
|
|
