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细胞冻存与细胞复苏标准操作规程

 从零学免疫 2023-04-29 发布于山东

实验背景

细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大 量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随 着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必 要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃, 理论上储存时间是无限的。

实验原理

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性, 加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形 成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时 间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

操作步骤

(一)细胞冻存

1. 配制含 10%DMSO 或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;

2.  取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接 将细胞移至 15ml 离心管中、;

3. 离心 1000rpm,5min;

4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均 匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为 5×106/ml~1×107 /ml;

5. 将细胞分装入冻存管中,每管 1~1.5 ml;

6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;

7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~ -10℃/ min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃ 冰箱 2h ,然后放入-80℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

(二)细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入 37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。

2. 从 37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加 10 倍 以上培养液,混匀;

3. 离心, 1000rpm,5min;

4. 弃去上清液,加入含 10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶, 37℃培养箱静置培养;

5. 次日更换一次培养液,继续培养。

注意事项

1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期 细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;

2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;

3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。

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