一、细胞冻存 方法: 冻存液最好现配:按1:3:6(或1:2:7) 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理, 对于贴壁细胞: 悬浮细胞:直接离心收集,PBS洗涤 注意事项:
细胞状态不好(长的太过了,培养液已经很黄;细胞可疑污染;细胞已 经开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月,细胞性状已有改变改变)。 解决: 最佳时机:细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。
冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。(复苏很难成功)。 解决: 离心后调整细胞浓度。(不要重新洗细胞)。
冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。 解决: 选择原配的管子和盖子(不同牌子/型号的颜色会有差别)。
放在-80度的冻存盒,壁太薄,细胞在被迅速降温。 解决: 选择厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量干棉花。(冻存的原则:缓降!)
放在-80度冰箱的时间超过半年。(冰箱的温度难以恒定:开门/关门,电压不稳等) 解决: 尽快转入液氮。
液面不能漫过所有细胞。 解决: 定期测量液氮储备,保证细胞全部浸在液面下。
找不到/拿错冻存管。 解决: 每支冻存管都标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。 二、细胞复苏: 方法:
注意事项:
拿错冻存管。(快快快,匆忙之中,难免出错,况且-170多度,冻手!) 解决: (1)核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。 (2)拿细胞时戴手套!
2min还没融化。(冻存管的壁较厚,隔热) 解决: (1)适当提高水浴温度(37度-40度)。 (2)要是冬天,就选用保温盒。
复苏1h后,还没有加入新的培养液。(高浓度DMSO防止胞内形成冰晶,冻存时保护细胞,但复苏融解后,浸泡时间太久会,对细胞有毒性) 解决: 提前预定超净台,减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
复苏三四天后,细胞没有任何动静,认为失败,倒掉所有细胞。(有些细胞复苏后一星期,才有起色) 解决: 不要换液,耐心等待,两周后再做决定 |
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