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免疫比浊法（Turbidimetric inhibition immuno assay）是临床常用的检测技术，是抗原抗体结合动态测定方法[1]。其原理为液相沉淀试验，即抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成小分子可溶性免疫复合物，在稀释系统中的促聚剂或者增浊剂作用下，自液相析出，迅速形成大分子免疫复合物微粒，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且恒量的情况下，形成的免疫复合物量随检测样本中抗原量增加而增加，浊度亦随之增大，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出样本中抗原的含量，待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。今天，我们就一起来了解一下免疫比浊检测技术。 免疫比浊法的分类 根据检测的光信号性质不同，免疫比浊法可分为免疫透射比浊和免疫散射比浊。两者基本原理均为抗原抗体反应，区别在于透射比浊法是在直射角度上测定光透射强度，当一定波长的光线通过反应液时，由于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收，测量通过反应体系后的透射光强度，即测定反应体系的吸光度，即可定量检测待测物质浓度，透射比浊法一般采用终点比浊法[2]。散射比浊法是在5~96°角的方向上测量散射光强度，当一定波长的光通过反应液时，溶液中的抗原抗体复合物会使入射光产生折射、偏转，从而产生散射光，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关，通过测定散射光的强度，即可定量检测待测物质浓度，散射比浊法分为速率比浊法和终点比浊法。二者检测的简易原理如下图一。  图1 透射比浊与散射比浊检测样本的简易原理 免疫透射与免疫散射优缺点 免疫透射比浊法优点：简便快速，结果准确性较好，抗干扰能力较强，能用一般比色仪、全自动或半自动生化分析仪进行测试，仪器试剂价格相对低廉。不足：①抗体用量较大，需要保证反应体系中抗体始终保持过量，但极度过剩时易导致免疫复合物分离，严重影响结果准确性；②溶液中免疫复合物分子若过小则阻挡不了光线的通过；若数量太少则对光通量影响不大；灵敏度较散射比浊法低；③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段，检测需在抗原-抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。第一种情况抗原过剩结果会有偏低情况出现，对于这种情况，如罗氏的微量白蛋白检测，通过增加一种试剂即抗原过剩检测试剂，检测反应杯内是否含有没有反应的过剩的抗原，如有出现报警，建议稀释测试。第二种情况IC通过促聚剂或者增浊剂使得免疫复合物出现可检测到的浊度改变[3]。第三种情况全自动化学仪的检测周期固定，在固定的周期内进行检测，不影响结果时间。 散射比浊法优点：线性范围宽，速率散射比浊法检测光强度变化的速率，在某一时间点抗原-抗体反应速率最快，单位时间内产生的免疫复合物含量达到最大值，散射光强度变化亦最大，此即为速率峰。速率峰的峰值与抗原浓度正相关。速率散射比浊法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点，稳定性好、自动化程度高、节省试剂，仪器和试剂价格比较贵，对抗体质量要求很高，需特定的分析仪器。 方法学的干扰因素 常见的干扰因素包括： 1、标本因素：（1）脂血：样本中含有大量乳糜颗粒引起脂浊，乳糜颗粒可以散射光线，使浊度增加，透光度下降，吸光度增加，从而干扰结果；（2）黄疸：胆红素及其衍生物在特定波长下有光吸收，引起本底吸光度的升高，从而干扰结果；（3）溶血：血红蛋白浓度越高，其本身吸光度对检测结果的干扰程度越高；（4）标本离心不彻底或反复冻融； 3、内源性干扰物质：RF、嗜异性抗体、人抗动物抗体、自身抗体、M蛋白等，试剂抗体的特异性要强。 4、钩状效应[4]：在抗体量恒定的溶液中加入抗原，免疫复合物的生成量随着抗原量的增加而增加，当达到峰值之后，则随着抗原量的增加而减少；抗原过剩检测试剂提示是否需要稀释测试。 5、其他药物干扰等。 本实验室检测项目 目前，临床检测中心开展的常规项目中，抗链球菌溶血素O抗体（ASO）、类风湿因子（RF）、补体C3、C4、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白轻链（KAP）、轻链（LAM）、前白蛋白（PA）、胱抑素C（CYS-C）、载脂蛋白A、载脂蛋白B、Lp(α)、转铁蛋白（TRF）、尿总蛋白（TPU）、微量白蛋白（mALB）等项目均采用免疫比浊法检测。 两种方法的实验室比对 以ASO、RF为例进行实验室比对，ASO为抗链球菌溶血素O抗体，升高说明可能存在溶血性链球菌感染。链球菌感染可导致风湿热，常见的是风湿性心脏病、风湿性关节炎等，在风湿热引起的风湿性关节炎的确诊中，具有重要参考价值。少数肝炎、肾病综合征、多发性骨髓瘤等可见升高[5]。RF为类风湿因子，是诊断类风湿关节炎的重要血清学标志之一，升高常见于类风湿性关节炎、自身免疫系统疾病、感染等[6]。 用两种方法分别检测ASO和RF，结果显示：透射比浊法具有较低的检出限及较高的精密度；散射比浊法具有较宽的检测范围[7-12]。近年来免疫透射比浊逐步成熟[13]，在实际工作中，往往透射比浊法检测更快捷，检出限更低，结果更准确，且室内质控、室间质评结果均显示透射比浊法测ASO和RF有较好的重复性和稳定性，血样可直接与生化检查样本合用，降低了采血成本，检测时间短等优势，总之，两种检测方法都有各自的优缺点，相对而言，免疫透射法更加实用和便捷。 参考文献 [1] 李金明,刘辉.《临床免疫学检验技术》，北京，科学出版社，2015. [2] 彭凤. 免疫透射比浊测定技术的进展和分析特性[J]. 检验医学, 2012, 27(004):252-256. [3]王会中,徐蓉.定量免疫分析技术的应用现状与展望[J].中华检验医学杂志,2017,40(6),478-480. [4]贾珂珂,孙文苑,聂睿等,免疫透射比浊法常见干扰因素的识别与应对策略[J],检验医学,2021,36(4):362-368. [5]尚红等.《全国临床检验操作规程》第4版，北京，人民卫生出版社，2014. [6] 中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会. 类风湿关节炎相关自身抗体检测的临床应用专家共识[J].中华内科杂志, 2021,60(6) : 516-521. [7]罗氏《抗链球菌溶血素O检测试剂盒》说明书 [8]罗氏《类风湿因子检测试剂盒》说明书 [9]国赛免疫测定特定蛋白比浊试剂盒抗链球菌溶血素O测定试剂盒使用说明书 [10]国赛免疫测定特定蛋白比浊试剂盒类风湿因子测定试剂盒使用说明书 [11]《苏州市独墅湖医院临床检测中心抗链球菌溶血素O（ASO）定量检测性能验证报告》 [12]《苏州市独墅湖医院临床检测中心类风湿因子RF定量检测性能验证报告》 [13] 李家明,康斌.免疫透射和免疫散射比浊法测定免疫球蛋白和补体的比较分析[J],现代诊断与治疗,2014,25(18):4224-4225. 撰稿：钱思程 崔嘉玥 排版：吴妍茜 审核：唐红辉 |
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