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如上图，RNA速率有三个内容。第一是Linux中上游操作获得Spliced/unspliced矩阵，这一步没有难度，但是比较费时间，比较费内存，建议在服务器上完成。第二部分是结合第一步的分析和单细胞seurat对象，进行RNA速率计算。这里我们提供了两种方式，一种是R语言版，考虑到大多数人没有接触过python，所以R语言版本我们提供了两种方式，足够你使用。另一种就是常见的python中进行分析了。python和R语言选择其中一种即可！RNA速率是单细胞分析中常用的一种方法，在各大单细胞相关文章中出现的频率很高。关于RNA速率的解释和原理，感兴趣的可阅读这篇原始的Nature文章：Gioele La Manno, Ruslan Soldatov, Amit Zeisel et al. RNA velocity of single cells. Nature, Published Online: 08 August 2018, doi:10.1038/s41586-018-0414-6。简单的概括就是RNA velocity可以推断细胞轨迹，和monocle等拟时分析一样，执行相似的功能。RNA velocity简单的原理理解为通过对剪接的（spliced）和未剪接的（unspliced）mRNA之间的丰度比值推断基因动力学，得出细胞状态变化， RNA 速率分析不需要指定起点和终点。RNA velocity可以结合monocle以及其他的拟时分析应用在研究中。当然，方法技术从来不是独立的，相互的使用才能达到更好的效果。RNA velocity的分析不是从单细胞对象mRNA。也就是基因表达水平的分析，他需要分析鉴定出剪
接体和未剪接体。所以，它的分析是从FASTQ开始，实际上常常是从bam文件开始。一般单细胞cellranger流程后，在此基
础上就可进行RNA velocity分析，RNA velocity用到的软件是velocyto。RNA velocity分析的第一步是从终端开始的。首先我们创建环境，安装软件。这些很基础，我们之前在
pyscenic和cellphonedb中已经进行过多次的演示了。###pay attention#To run velocyto you will need python >=3.6.0 (we have no plans to support python<=3.5).#conda install numpy scipy cython numba matplotlib scikit-learn h5py click 这些包都要安装#pip install pysamconda create -n velocyto python=3.7conda activate velocytoconda install numpy scipy#新的环境服务器没有安装这些的安装上，不然安装velocyto会报错
#安装velocytopip install velocyto -i http://pypi.douban.com/simple/ --trusted-host pypi.douban.com
Linux终端进行velocyte分析：velocyte有三个子命令，分别是： run10x - Run on 10X Chromium samples run_smartseq2 - Run on SmartSeq2 samples run_dropest - Run on DropSeq, InDrops and other techniques run - Run on any technique (Advanced use)看名字就知道他们是干什么的，分别对应相关的测序方式，最后的run则是通用的，只不过需要准备好相关的文件。这里我
们以10X的数据为例，事实上其他的数据也是一样的，上游分析后得到bam文件分析不成问题。1、参考基因组（10X官网下载，对应于你跑cellranger时候的版本，注意物种，这里的示例是人的），当然了，如果你自己
跑了cellranger流程，这个文件肯定下载了，也知道它的路径。下载地址：Downloads -Software -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support2、repeat annotation文件，下载地址：Table Browser (ucsc.edu)。物种选择对！例如这里我们选择人的：在分析时，我们要进入的是cellranger运行结束后存储文件的目录，例如这里的./SRR19842866，里面包含outs等文件夹。（假设是公司分析的数据，我们要自己做速率分析，那么只需要拿来cellranger结果文件就可以了，不需要从FASTQ
开始）。这个分析过程比较漫长，挂起，不要死等！我这里是一个样本一个样本分开做的，因为怕内存不够，没有使用批量循环。cd SRR19842866/velocyto run10x -m /home/ziv/biosoft/repeat/human_rmsk.gtf./ /home/ziv/biosoft/refdata-gex-GRCh38-2020-A/genes/genes.gtf
至于smartseq2、dropest等命令就不再深究学习演示了（太麻烦，也是懒的弄了），直接看看通用形的命令吧，这样不论
什么情况都可以正常的运行。命令如下：这里的possorted_genome_bam.bam这个bam文件是比对到基因组后使用samtools软件用position排序（sort）之后的
文件。对于10x的cellranger，在outs文件夹里面已经生成了这样的文件，也就是说，你只需要这个bam就可以分析了，不
需要上述的所有文件。filtered_barcodes.tsv也就是outs文件夹里面filtered文件夹下的barcodes文件（需要解压）。output_path就是输出路径！velocyto run\-b filtered_barcodes.tsv \-o output_path \-m repeat_msk_srt.gtf possorted_genome_bam.bam mm10_annotation.gtf
多组数据合并：前面我们是单独一个个组进行分析的，那么每个样本都产生了一个loom文件，首先我们将这些文件合并。我们写一个简单的py脚本进行合并，直接在终端运行即可。cat merge_veloom.py#import loompy#files=["SRR19842866.loom","SRR19842867.loom","SRR19842870.loom"]#loompy.combine(files, "uterus.loom", key="Accession")python merge_veloom.py
做完这些，对于RNA速率分析来讲，就算是完成一半的工作了，前面的分析倒是不难，就是比较耗费时间和耗费内存！接下来进行RNA速率估计分析，然后进行可视化就是我们在文章中常见的形式了。其实RNA velocity分析本来就是一个基于python的分析软件，后续的动力学评估分析和可视化都是在python进行的，当然
了，也有小伙伴习惯用R，R也有对应的R包，但是分析可视化就比较单一了。不过这里，我们还是提供两种方式的分析可视化，希望对你的研究有帮助。当然了，后续的分析也是基于我们已经构建好了单细胞对象，并进行了细胞群的注释，毕竟你
的速率是要看在细胞中的变化。
分析可视化见后续帖子，觉得分享有用的点个赞，分享下再走呗！
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