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原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一种以皮肤黏膜出血为主要临床表现的获得性自身免疫性出血性疾病，严重者可出现脏器出血，甚至发生颅内出血。ITP既往亦被称为特发性血小板减少性紫癜，其发生率约占全部出血性疾病的1/3[1]。成年人ITP的年发病率为(5～10)/10万，育龄期女性发生率高于同年龄男性[2]。阻止由免疫介导的血小板过度破坏，在ITP治疗中非常重要，肾上腺糖皮质激素和免疫抑制剂是其常用药物，该类药物虽有一定疗效，但是长期使用不仅费用昂贵，还可产生较多严重不良反应[3]。因此，寻找更为安全、有效且经济的新治疗靶点，对ITP的治疗尤为重要。 维生素D3是一种廉价且相对安全的营养补充药物，其活性形式25-羟基维生素D3[25(OH)D3]主要通过与淋巴细胞上的维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合，而发挥免疫调控作用[4]。既往研究结果显示，维生素D3缺乏及VDR表达异常不仅与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)，类风湿性关节炎，系统性硬化症等多种自身免疫性疾病的发生有关，而且与过敏性紫癜、非霍奇金淋巴瘤等多种血液系统疾病的发生有关[5,6]。因此笔者推测，作为自身免疫性出血性疾病，25(OH)D3和VDR在ITP发生、发展中具有重要作用，但是具体作用机制尚未明确。本研究通过检测初诊ITP成年患者血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平，并且分析上述二者与其ITP相关实验室检查结果的相关性，旨在探索25(OH)D3及VDR在初诊成年人ITP发病中的作用。现将研究结果报道如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象 选择2019年1月至2019年12月，于河北北方学院附属第一医院血液科门诊及住院部收治的55例初诊ITP成年患者为研究对象，并纳入ITP组(n＝55)。患者年龄为(42.6±11.8)岁；男性患者为19例，女性为36例。根据其治疗2个月后的疗效，将ITP组患者分为完全反应(complete response，CR)，有效和无效亚组。研究对象纳入标准：①满足《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》中，初诊ITP诊断标准[7]；②年龄为18～75岁；③既往无脾切除手术史；④10×109/L≤血小板计数<30×109/L。排除标准：①由其他因素所致的血小板减少者，如血小板消耗性减少、同种免疫性血小板减少、感染、自身免疫性疾病、淋巴系统增殖性疾病、恶性血液系统疾病或药物诱导等；②合并其他严重疾病者；③入组前1个月内接受血小板输注或使用相关药物治疗者；④肝、肾功能不全者；⑤伴精神、行为障碍者。同时选取同期于我院体检中心参加体检的30例性别、年龄相匹配的健康志愿者，纳入健康对照组(n＝50)，其年龄为(43.9±12.4)岁；男性受试者为23例，女性为32例。ITP组患者和健康对照组受试者的性别、年龄等基本资料分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院医学伦理委员会批准(批准文号：k2020060)，所有受试对象均签订临床研究知情同意书。 1.2 方法 1.2.1 主要试剂和仪器 人25(OH)D3酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：20181004，上海鑫乐生物科技有限公司)；人VDR ELISA试剂盒(批号：1809025，上海莼试生物技术有限公司)。Bio-Rad 550型全自动酶标仪(美国伯乐公司)。TDZ5-BP型离心机(长沙湘锐离心机有限公司)。 1.2.2 ITP组患者治疗方法 对所有初诊ITP成年患者采取初始治疗方案，对血小板计数<30×109/L且伴出血的患者加用联合治疗方案。初始治疗方案为口服醋酸泼尼松片(批号：181105,吉林长白山药业)+维D钙咀嚼片(批号：180907,中山安士制药)。其中，醋酸泼尼松起始剂量为1.0 mg/ (kg·d)，待病情稳定后快速减至最小维持量(< 15 mg/d)进行维持治疗，疗程为14 d；维D钙咀嚼片每片含维生素D3 100 IU(2.5 μg)和碳酸钙750 mg，剂量为1片/次×2次/d×14 d。联合治疗方案包括：①静脉输注静脉注射用人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulinp，IVIG)(批号：20181006，四川远大蜀阳药业有限公司)，剂量为0.4 g/(kg·d)×5 d；②静脉滴注重组人血小板生成素(thermoplastic polyolefin，TPO)注射液(批号：181007，沈阳三生制药有限公司)，剂量为300 U/(kg·d)×14 d，至患者血小板计数≥100×109/L时停药；③静脉滴注利妥昔单抗注射液(批号：20181109，上海罗氏制药有限公司)，剂量为375 mg/(m2·次)×1次/周×4周；④口服环孢素软胶囊(批号：181003，浙江瑞邦药业有限公司)，剂量为5 mg/(kg·d)×8周，分2次服用。 1.2.3 标本采集 分别于治疗前及治疗2个月后，采集ITP组患者的空腹肘静脉血各4 mL，分装于2支乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，2 mL/管。采集健康对照组受试者参加体检当日空腹肘静脉血4 mL，分装于2支EDTA抗凝管中，2 mL/管。 1.2.4 血清25(OH)D3水平测定 将采集的ITP组患者治疗前、后及健康对照组受试者的1支EDTA抗凝管中的2 mL全血标本，于4 ℃下1 000×g离心10 min，分离上层血清，并且储存于-20℃冰箱中，待测。采用ELISA法，以及人25(OH)D3 ELISA试剂盒及Bio-Rad 550型全自动酶标仪，检测所有血清标本的25(OH)D3水平。实验操作严格按照仪器及试剂盒说明书进行。 1.2.5 外周血淋巴细胞VDR水平测定 将采集的ITP组患者治疗前、后及健康对照组受试对象的1支EDTA抗凝管中的2 mL全血标本，进行淋巴细胞的分离和裂解。具体方法为：将全血标本加入含有5 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中，以600×g离心30 min，小心吸取白色淋巴细胞层并置于微量离心管中，再将该离心管以1 800×g离心5 min，保留底部沉淀，若红细胞裂解不充分(即离心管底有可见红色沉淀)，则加入1 mL红细胞裂解液，静置10 min后，再以1 800×g离心5 min，弃去上清液，将上述底部沉淀加入5 mL Homogenization缓冲液中，调整淋巴细胞终浓度至5×107个/L，再以10 000×g离心15 min，吸取上层清液待测。采用ELISA法，以及人VDR ELISA试剂盒及Bio-Rad 550型全自动酶标仪，检测所有淋巴细胞标本的VDR水平。实验操作严格按照仪器及试剂盒说明书进行。 1.2.6 ITP组患者的疗效判定标准 ITP组患者于接受治疗2个月后进行疗效评价，若2次血小板计数≥100×109/L，并且未发生出血者，则疗效判定为CR；2次血小板计数≥30×109/L且高于治疗前血小板计数基础值的3倍，未发生出血者，则为有效；若血小板计数<30×109/L，或血小板计数增加值<治疗前血小板计数基础值的2倍，或者发生出血，则为无效[7]。总有效率(%)＝(CR患者数+有效患者数)/总例数×100%。 1.2.7 观察指标 采用回顾性病例对照研究方法，收集ITP组患者治疗前、后及健康对照组受试者体检时的血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平，以及ITP组患者治疗前实验室检查指标。实验室检查结果包括：血小板计数及血清C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，血小板膜表面相关免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M(platelet associated IgM，PAIgM)，血小板膜表面相关IgG(platelet associated IgG，PAIgG)和血小板表面相关补体C3(platelet associated complement C3，PAC3)水平。 1.3 统计学处理方法 本研究所得数据采用SPSS19.0统计学软件包进行统计学处理。采用Ssize软件，确定满足本研究统计检验的最小样本量。呈正态分布的血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平的计量资料，采用( 2 结果 2.1 ITP组患者疗效 ITP组55例患者接受治疗2个月后，疗效达CR者为28例，有效者为12例，无效者为15例，并将其分别纳入CR亚组(n＝28)、有效亚组(n＝12)和无效亚组(n＝15)。ITP组患者总有效率为72.7%(40/55)。 2.2 ITP组和健康对照组受试者血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较 ITP组患者治疗前，血清25(OH)D3水平为(10.3±3.8)ng/mL，显著低于健康对照组的(15.5±5.3)ng/mL，外周血淋巴细胞VDR水平为(219.6±79.4)nmol/L，显著高于后者的(159.8±52.3)nmol/L，并且差异均有统计学意义(t＝5.254、P<0.001，t＝3.702、P<0.001)。治疗后，2组受试者的血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平分别比较，差异均有统计学意义(t＝2.096、P＝0.039，t＝2.038、P＝0.045)，见表1。ITP组患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较，差异亦有统计学意义(t＝3.541、 P＝0.001，t＝2.332、P＝0.022)，见表2。  点击查看表格 表1 治疗后ITP组患者和健康对照组受试对象血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较( 表1 治疗后ITP组患者和健康对照组受试对象血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较(
注：ITP为原发性免疫性血小板减少症，25(OH)D3为25-羟基维生素D3，VDR为维生素D受体  点击查看表格 表2 ITP组患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较( 表2 ITP组患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较(
注：ITP为原发性免疫性血小板减少症，25(OH)D3为25-羟基维生素D3，VDR为维生素D受体 2.3 CR、有效和无效亚组患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较 CR、有效和无效亚组患者治疗前血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平分别比较，差异均无统计学意义(F＝2.682、P＝0.078，F＝1.140、 P＝0.327)；3组治疗后上述2个指标分别比较，差异均有统计学意义(F＝5.157、P＝0.009，F＝4.458、P＝0.016)。其中，CR亚组患者治疗后血清25(OH)D3水平显著高于治疗前(t＝2.432，P＝0.018)，外周血淋巴细胞VDR水平显著低于治疗前(t＝2.077，P＝0.043)；有效和无效亚组患者治疗前、后比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CR、有效和无效亚组患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较，见表3。  点击查看表格 表3 CR、有效和无效亚组ITP患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较( 表3 CR、有效和无效亚组ITP患者治疗前、后血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平比较(
注：CR为完全僵解，ITP为原发性免疫性血小板减少症，25(OH)D3为25-羟基维生素D3，VDR为维生素D受体 2.4 ITP组患者治疗前血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平与其实验室检查结果的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，ITP组患者治疗前血清25(OH)D3水平与其血清CRP、PAIgM、PAIgG和PAC3水平呈显著负相关关系(r＝-0.527、P＝0.006，r＝-0.319、P＝0.015，r＝-0.436、 P＝0.008，r＝-0.347、P＝0.009)，与其血小板计数呈正相关关系(r＝0.778，P＝0.001)。ITP组患者治疗前外周血淋巴细胞VDR水平则与其血清CRP、PAIgM、PAIgG和PAC3水平呈显著正相关关系(r＝0.415、P＝0.008，r＝0.279、P＝0.029, r＝0.352、P＝0.011，r＝0.308、P＝0.017)，与其血小板计数则呈负相关关系(r＝-0.639、P＝0.002)。 2.5 ITP组患者治疗前血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，ITP组患者治疗前血清25(OH)D3水平与其外周血淋巴细胞VDR水平呈显著负相关关系(r＝-0.983，P<0.001)。 3 讨论
25(OH)D3在调节机体钙、磷代谢中具有重要作用。Akkus等[8]研究结果显示，低水平的25(OH)D3可能与急性ST段抬高型心肌梗死患者无自发再灌注及病情严重程度、主要心血管不良事件发生率增加有关。刘伟[9]研究结果显示，反复上呼吸道感染组(n＝60)患儿血清白细胞介素(interleukin，IL)-17水平较健康对照组(n＝60)显著升高，而血清IL-10、25(OH)D3水平均显著降低，并且差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示，25(OH)D3缺乏可能是反复上呼吸道感染患儿血清IL-17表达上调和IL-10表达水平下调的关键原因之一。Zhao等[10]研究亦发现，严重维生素D缺乏[血清25(OH)D3水平<10 ng/mL]可影响活动期SLE患者外周血单个核细胞自噬相关基因(autophagy associated gene, ATG)和T淋巴细胞亚群的表达，并且25(OH)D3可能通过调节自噬功能发挥免疫调控作用。由此可见，25(OH)D3缺乏还可能与部分心血管疾病、呼吸系统疾病和自身免疫性疾病等多种疾病的发生关系密切，目前其具体作用机制尚未完全阐明，可能与25(OH)D3所具备的免疫调节作用有关。而25(OH)D3主要通过与体内VDR结合，以发挥免疫调控作用，其中VDR属于核受体超家族成员，表达于人体免疫系统中的大多数细胞类型中，故而25(OH)D3对机体免疫系统亦具有多方面的影响。 既往研究结果表明，25(OH)D3可调控T细胞增殖和分化，包括诱导初始CD4+T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)分化，抑制辅助性T细胞(helper T cell，Th)1增殖，并且降低其功能等；25(OH)D3能明显下调B7等共刺激分子及主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子在单核细胞中的表达，从而削弱其抗原呈递和启动T淋巴细胞免疫应答的能力；25(OH)D3还能对各个成熟阶段的树突状细胞(dendritic cell，DC)产生影响，其中DC是专职抗原呈递细胞，在激活T淋巴细胞免疫反应中必不可少，而25(OH)D3既可抑制单核细胞向DC分化，又可抑制DC的成熟，从而减少DC分泌的IL-12，同时增加IL-10的释放，最终诱导出具有致耐受性表型和功能的未成熟DC[11,12]。因此，25(OH)D3作为免疫调节剂的优势在于，既可达到防治疾病的效果，又不易产生全身性免疫抑制作用，已逐渐成为临床医学领域中备受关注的热点[13]。 李姜惠子等[14]报道，ITP患者外周血中CD4+T细胞异常表达可能与其体内血小板相关抗体的产生有关，其可能机制是初始CD4+T细胞在双信号(第一、二信号)刺激下活化，并分化为效应性T细胞，通过γ干扰素、IL-17等多种细胞因子和CD28/B7、CD40/CD154等外周血T、B细胞表面协同刺激分子，与自身反应性B细胞相互作用，以诱导B细胞增殖与分化，并且刺激其大量分泌自身抗体，进而可对血小板造成持续性的破坏，最终导致ITP的发生、发展。Th1和Th2是CD4+T细胞的2种亚型，正常情况下Th1、Th2处于动态平衡状态，二者相互调节、相互抑制。吴晓勇等[15]研究指出，ITP患者体内存在Th1/Th2比例失衡，表现为Th1/Th2免疫平衡向Th1漂移，即Th1细胞介导的免疫排斥增强。Treg细胞是机体重要的T细胞亚群，虽然其在健康个体外周血CD4+T细胞中仅占5%～10%，但是Treg功能缺陷或数量减少可能与ITP发生、发展有密切关系[16,17]。研究结果证实，T细胞中存在VDR，其中CD4+T细胞是25(OH)D3对T细胞调节作用的直接靶点，尤其是γ干扰素、IL-2等Th1细胞因子[18]。同时，25(OH)D3还可诱导初始CD4+T细胞向Th2分化，即Th1/Th2免疫平衡向Th2漂移，纠正Th1/Th2免疫失衡。此外，顾悦等[19]建立ITP模型小鼠的动物实验结果显示，使用1，25-二羟维生素D3[25(OH)D3代谢产物]治疗，有助于改善小鼠的精神状态、进食量等一般情况，增加其体重及血小板数量，促进其骨髓血小板生成、降低出血风险等。由此笔者推测，25(OH)D3缺乏和(或)VDR表达异常，可能参与ITP的发生、发展，并且其表达水平与ITP患者病情严重程度有关。本研究结果显示，治疗2个月后，55例ITP组患者中，CR患者为28例，有效者为12例，无效者为15例，ITP组患者总有效率为72.7%(40/55)。这提示，经初始治疗+联合治疗方案，ITP患者治疗效果仍不理想，需进一步探索ITP的新治疗靶点及有效、安全的治疗方案。 VDR是高等脊椎动物体内激素25(OH)D3唯一已知的调节物，25(OH)D3可通过靶器官组织细胞上的VDR发挥作用，VDR的功能在本质上可反映25(OH)D3的功能。穆玮等[20]研究结果显示，ITP组(n＝45)患者外周血中25(OH)D3水平显著低于健康对照组(n＝33)，VDR mRNA水平则显著高于后者，并且差异均有统计学意义(P<0.05)。本研究结果显示，ITP组患者治疗前血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平分别与健康对照组比较，差异均有统计学意义(t＝5.254、P＝0.000，t＝3.702、P＝0.000)；治疗后2组上述指标分别比较，差异均无统计学意义(t＝2.096、P＝0.039，t＝2.038、P＝0.045)；ITP组患者治疗前、后上述2项指标分别比较，差异有统计学意义(t＝3.541、P＝0.001，t＝2.332、P＝0.022)。上述结果均提示，血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR在ITP发生中具有重要意义，25(OH)D3缺乏可能是ITP的发病原因之一。 初诊ITP成年患者经规范治疗后，血清25(OH)D3水平与其治疗效果密切相关，具体表现为治疗后血清25(OH)D3水平越高，血小板计数越高，治疗效果越好，即初诊ITP成年患者血清25(OH)D3水平与血小板计数呈正相关关系[20]。本研究结果显示，CR、有效和无效亚组患者治疗前血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平分别比较，差异均无统计学意义(F＝2.682、P＝0.078, F＝1.140、P＝0.327)；3组治疗后上述2项指标分别比较，差异均有统计学意义(F＝5.157、P＝0.009，F＝4.458、P＝0.016)。其中，CR亚组治疗后血清25(OH)D3水平显著高于本组治疗前(t＝2.432，P＝0.018)，外周血淋巴细胞VDR水平显著低于本组治疗前(t＝2.077，P＝0.043)；有效和无效亚组患者本组内治疗前、后分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，这与穆玮等[20]研究结果相符。 CRP作为一种急性期反应物和炎症标志物，能与ITP患者血小板上由于血小板抗体触发氧化作用而暴露出来的磷脂胆碱相结合，可能会增强血小板表面相关抗体所介导的血小板破坏，故血清CRP水平可反映ITP患者机体免疫状态和血小板破坏的程度。PAIgM、PAIgG和PAC3是ITP患者体内重要的抗血小板抗体，这些抗体是体液免疫破坏血小板的主要介质。本研究结果显示，ITP组患者治疗前血清25(OH)D3水平与其血清CRP、PAIgM、PAIgG和PAC3水平呈显著负相关关系(r＝-0.527、P＝0.006，r＝-0.319、P＝0.015, r＝-0.436、P＝0.008，r＝-0.347、P＝0.009)，与其血小板计数呈正相关关系(r＝0.778，P＝0.001)。ITP组患者治疗前外周血淋巴细胞VDR水平则与其血清CRP、PAIgM、PAIgG和PAC3水平呈显著正相关关系(r＝0.415、P＝0.008，r＝0.279、P＝0.029，r＝0.352、P＝011，r＝0.308、 P＝0.017)，与其血小板计数则呈负相关关系(r＝-0.639，P＝0.002)。这提示，初诊ITP成年患者血清25(OH)D3和外周血淋巴细胞VDR水平能间接反映其疾病进展情况和机体免疫功能状况。究其原因，可能为当B细胞功能亢进时，引起体内25(OH)D3的减少，进而使25(OH)D3对B细胞的抑制作用减弱，导致B细胞过度增殖和活化，从而造成患者体内25(OH)D3水平持续降低；而当25(OH)D3不足或缺乏时，一方面Th1活动会增强，致使IL-2、γ干扰素等相关细胞因子大量合成与分泌，进而介导细胞免疫，来诱导或加剧机体免疫失耐受；另一方面B细胞数量增加且功能被过度激活，除了大量产生抗血小板抗体，介导体液免疫外，还可通过产生细胞因子和增强的抗原呈递作用来激活机体免疫系统；另外DC不断成熟与分化，使得共刺激分子和MHC Ⅱ类分子的表达异常增加，促进T细胞激活，进一步提高抗原呈递效率，以致自身免疫反应持续存在，最终可诱导或加剧患者对自身抗原的免疫失耐受，导致细胞及体液免疫介导的血小板破坏进行性增多，巨核细胞产生血小板的能力进行性减弱，从而加速ITP进程[21,22]。因此，对于初诊ITP成年患者外源性补充25(OH)D3可抑制B细胞的异常增殖与活化，同时可抑制Th1细胞活动，增强Th2细胞免疫应答，起到正向调控Th1/Th2免疫平衡的作用，从而有助于控制患者病情进展。 本研究结果显示，ITP组患者治疗前血清25(OH)D3水平与其外周血淋巴细胞VDR水平呈显著负相关关系(r＝-0.983，P<0.001)。究其原因，可能与初诊ITP成年患者体内25(OH)D3水平显著降低，引起VDR水平代偿性增高，以增加25(OH)D3与VDR的有效结合，从而弥补25(OH)D3的不足有关。 综上所述，25(OH)D3缺乏与初诊成年人ITP的发病相关，该类患者血清25(OH)D3水平与外周血淋巴细胞VDR水平呈显著负相关，并且二者均与初诊ITP成年患者病情严重程度有关。25(OH)D3缺乏可能作为重要的环境致病因子，对自身抗体的产生和机体免疫失衡起到'扳机'作用，增加成年人ITP遗传易感者的发病风险，在成年人ITP的发生、发展和疾病慢性化过程中扮演着重要角色，补充维生素D3及其类似物可能成为ITP辅助治疗的新手段之一。但是对该新靶点的治疗效果，仍有待进一步的体内、外相关研究结果证实。 |
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±s)表示，3组间比较采用方差分析，2组间和组内治疗前、后比较，分别采用独立样本和配对样本t检验。ITP组患者血清25(OH)D3、外周血淋巴细胞VDR水平与其治疗前实验室检查结果的相关性分析，采用Pearson相关性分析。本研究所有统计学检验采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
±s)
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