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导语 长链非编码 RNA (lncRNA) 在乳腺癌中起着关键的调节作用。然而，群体水平的差异表达分析方法忽略了个体患者中lncRNA的异质表达。 今天小编为大家带来的这篇文章，作者使用 LncRNA 个体化 (LncRIndiv) 方法对乳腺癌 (BRCA) 的 lncRNA 表达谱进行个体化。文章发表在《Oncogene》上，影响因子为：8.756，文章题目为：Individualized lncRNA differential expression profile reveals heterogeneity of breast cancer。
IDElncRNA 配置文件中包含 3,458 个 lncRNA，五重验证测试的平均准确度在样本和 lncRNA 水平均高于 95%（图 1A）。在 IDElncRNA 谱中，1,909 个 lncRNA 被下调，1,549 个 lncRNA 被上调，lncRNA 在 9.8% 的 BRCA 样本中差异表达。下调和上调的 lncRNA 分别占 BRCA 样本的 12.2% 和 6.8%，表明 IDElncRNA 在 BRCA 中倾向于被抑制（图 1B）。为了比较来自 FC 和 LncRIndiv 的差异表达，本研究将 3,458 个 lncRNA 分为两组：具有一致 FC 方向的 IDElncRNA 和非 IDElncRNA。在这里，在 105 个成对的癌症-正常 BRCA 样本中，具有一致 FC 方向的上调 IDElncRNA 的 FC 分布大于非 IDElncRNA（图 1C)。下调的 IDElncRNA 也表现出相同的趋势（图 1C）。这些结果表明，与非 IDElncRNA 相比，IDElncRNA 往往具有更大的变化幅度，并且更有可能表达不同。 
图 1 lncRNA 的差异表达可能是基因组或表观遗传改变的结果。因此，本研究进一步研究了 lncRNA 的 CNV 和 DNA 甲基化。本研究假设扩增或低甲基化会诱导 lncRNA 的上调，而高甲基化或缺失会导致 lncRNA 的下调。对于前 100 个最常见的差异表达 lncRNA，估计了每个 lncRNA 的一致性，其中一致性意味着在一个乳腺癌样本中上调的 lncRNA 也显示出扩增或低甲基化，反之亦然。 其中66 个 lncRNA 的差异表达 100% 一致，24 个 lncRNA 与 CNV 或 DNA 甲基化部分一致，而 10 个 lncRNA 显示与 CNV 或 DNA 甲基化不一致（图 1D）。LncRNA 的差异表达与异常 DNA 甲基化或 CNV 有关（图 1D）。因此，lncRNA 的差异表达与 CNV 或差异甲基化之间的一致性表明 LncRIndiv 的可靠性。 具有相同受体的BRCA亚型具有共同的IDElncRNA按照 CSCO 亚型分类，TNBC 亚型最具侵袭性并且具有最多的 IDElncRNA，其次是 HER2 /HR - 亚型和 luminal A 亚型（图 2A）。本研究在 TNBC 和 HER2 /HR - 亚型之间发现了 250 个过度表达的 lncRNAs，它们共享阴性 ER 和 PR。尽管 luminal B 亚型中过度表达的 lncRNA 数量最少，TNBC 亚型与 luminal B 亚型共有 65 个过度表达的 lncRNA。因此，luminal B 和 TNBC 亚型可能在 lncRNA 水平上具有相似的机制。Luminal A 和 HER2 /HR - 亚型没有激素受体和 HER2 状态，只有一个共同的 lncRNA（图 2A）。具有高频率的亚型特异性 IDElncRNA 如图 2B 所示。在所有 BRCA 亚型中，TNBC 具有最多的亚型特异性 lncRNA（图 2A）。LncRNA 通过与蛋白质和 DNA 结合来调节 DNA 修复和甲基化，因此，IDElncRNA 可以协同改变蛋白质编码基因的遗传和表观遗传修饰。亚型特异性 IDElncRNA 的差异表达显示与 CNV、体细胞突变或每个亚型中蛋白质编码基因的差异甲基化显著共现（图,2C-G）。值得注意的是，HRAS、PTDSS2、ZFP42、LOH12CR1 和 SLC6A13 的 CNV 在所有亚型中均与 IDElncRNA 显著共现（P < 0.05）， TP53 和 PIK3CA 中的体细胞突变显示与四种亚型中的 IDElncRNA 共现，除了 luminal B（图 2C-F）。至于差异甲基化，只有肿瘤抑制基因 TSPAN32 与 HER2 /HR - 亚型和 luminal B 亚型中的 IDElncRNA 共现（图 2E、G）。此外，TTN 基因的甲基化和突变分别与 HER2 / HR 亚型和 TNBC 亚型中的 IDElncRNA 共现。
图 2
Hub 亚型特异性 lncRNA，如 AL157394.1 (ENSG00000261438)、RP11-284N8.3 (ENSG00000259834) 和 Z99774.1 (ENSG00000206028)，可能通过与编码基因的其他改变合作参与 BRCA 亚型的进展。在 luminal A 亚型中，lncRNA AL157394.1 显示与某些基因（AGR2、STON2 和 RPH3AL）的差异甲基化共现，这些基因与细胞运输功能相关（图 2D)。RP11-284N8.3 在 T 细胞活化中起重要作用，并与免疫系统相关基因的差异甲基化共同发生（图 2E)。此外，结肠癌相关基因也参与了与 RP11-284N8.3 的共现（图 2E）。在luminal B 亚型中，溶质载体家族的 SLC5A5 和 SLC25A21 以及 DNA 结合家族的 FOXI1 和 KLF3 与 Z99774.1 共同出现（图 2G）。上述结果表明，亚型特异性lncRNAs可能通过与突变、CNV或编码基因差异甲基化的协同改变参与BRCA亚型。TNBC 是最恶性的 BRCA 亚型，在 BRCA 亚型中具有最多的 IDElncRNA（图 2A）。基于 27 个 TNBC 生存相关 lncRNA，本研究将 90 个 TNBC 样本分为两类，包括 67 个样本（第 1 类）和 23 个样本（第 2 类）。为了表征这两个类别，本研究确定了 1 类和 2 类特定的蛋白质编码基因以及相关通路。1 类富含参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT 信号通路和 T 细胞受体信号传导的基因的差异表达（P < 0.05，图 3A），表明 1 类倾向于解除对免疫系统的调节。因此，本研究将 1 类定义为免疫亚型。对于第 2 类，差异表达基因在 Wnt 信号通路、粘附连接和细胞外基质-受体相互作用通路中富集（P < 0.05，图 A）。因此，第 2 类被定义为间充质亚型。
图 3 由于两种 TNBC 亚型具有不同的转录组学特征，本研究进一步研究了蛋白质表达的差异。蛋白质 MAPK 在间充质亚型中显著表达（图 3B）。SNAIL 蛋白是一种显著的上皮间充质转化 (EMT) 诱导剂，在间充质亚型中的表达高于免疫亚型（图 3B）。此外，TGF-β 信号通路中的 SMAD3 蛋白和 JAK-STAT 信号通路中的 Bcl-xL 蛋白在免疫亚型中上调（图 3B）。 本研究将 IDElncRNA 亚型与之前发布的亚型进行了比较。本研究的亚型与 Thorsson 等人的免疫亚型显著相关（图 3C）,大多数 TNBC 肿瘤被 Thorsson 等人归类为 C2 免疫亚型，在本研究中，63.6% 的免疫亚型与 C2 重叠，45.5% 的间充质亚型为 C2。间充质亚型倾向于与 C3 重叠。此外，本研究还发现具有间充质亚型的 TNBC 患者的预后比具有免疫亚型的 TNBC 患者更差（图 3D）。 本研究整合了多组学数据，以在基因组和表观遗传水平上识别两种 TNBC 亚型的特征性改变。在表观遗传水平上，免疫亚型显示出比间充质亚型更高频率的 BRCA1、IL2RA、GATA2 和 SMAD2 差异甲基化（图 4A）。高度甲基化的 BRCA1 支持 BRCAness 表型并导致 HRD。具有免疫亚型的 TNBC 患者的 HRD 评分显著高于具有间充质亚型的患者（图 4B）。在免疫亚型中，本研究观察到低甲基化 IL2RA 的频率高于间充质亚型，它编码调节性 T 细胞的 CD25 标记。PDGFRA 是一种由巨噬细胞分泌的细胞表面酪氨酸激酶受体，在免疫亚型中出现的超甲基化频率高于间充质亚型（图 4A）。相比之下，间充质亚型患者的 VIM 超甲基化和 LAMA1 突变频率更高（图 4A）。 为了表征 TNBC 亚型之间的肿瘤免疫微环境，本研究比较了包括 PD-1 和 PD-L1 在内的免疫调节剂的表达、肿瘤突变负荷 (TMB) 和两种亚型之间的 HRD 评分。免疫亚型患者的突变和非沉默突变明显多于间充质亚型患者（图 4C），而 SNV 新抗原负荷差异略显著（图 4C)。这些结果表明，免疫亚型的基因组不稳定性可能诱导新抗原免疫靶点，免疫亚型患者表达增加的免疫系统抑制基因表达以实现免疫逃逸。本研究进一步评估了两种 TNBC 亚型中肿瘤浸润性免疫细胞的比例。基于 xCell、TIMER 和 CIBERSORT，本研究发现间充质亚型的巨噬细胞浸润始终高于免疫亚型（图 4D-E）。具体而言，CIBERSORT 和 xCell 的结果都支持间充质亚型中浸润性巨噬细胞 M2 的比例高于免疫亚型（图 4D-E）。各种 T 细胞，包括 CD4 记忆 T 细胞和滤泡辅助性 T 细胞，在免疫亚型中显示出比间充质亚型更高的免疫细胞浸润（图 4D）。
图 4 IDElncRNAs 调节 TNBC 中的免疫通路。为了深入了解 27 种 lncRNA 在免疫调节中的功能，本研究检查了由 ImmLnc 数据库识别的 lncRNA 通路对，并构建了一个具有免疫基因的共表达调控网络。27 种 lncRNA 中有 12 种与免疫通路相关基因共表达，然而只有表达细胞因子受体、细胞因子和参与抗原加工和呈递通路的基因在所有 TNBC 样本中显示出与 IDElncRNA 的显著共表达。包括 PDCD1 和 CTLA4 在内的免疫调节剂与 lncRNA ENSG00000255455 共表达，表明 ENSG00000255455 是免疫亚型中免疫逃避的关键调节因子（图 4F）。LncRNA PTOV1-AS1 调控MDA-MB-231细胞EMT过程LncRNA PTOV1-AS1在间充质亚型中差异表达频率最高。在用 TGF-β1 处理的 MDA-MB-231 细胞中，PTOV1-AS1 和 lncRNA AATBC 均增加（图 5A）。为了进一步探索 PTOV1-AS1 对 EMT 过程的功能影响，本研究将 PTOV1AS1 过表达质粒转染到 MDA-MB-231 细胞中（图 5B）。本研究发现 PTOV1-AS1 的强制表达导致 TJP1 (ZO-1) 和 CDH1 (E-钙粘蛋白) 的下调以及波形蛋白和 SNAI1/2 在 mRNA 水平上的上调（图 5C）。同时，PTOV1-AS1 的过表达降低了 ZO-1 和 E-钙粘蛋白的表达，并增加了波形蛋白在蛋白质水平的表达（图 5D）。此外，免疫荧光测定进一步证实，PTOV1-AS1 的过表达可显著降低 MDAMB-231 细胞中 ZO-1 的染色强度（图 5E）。如图 5F-G 所示，PTOV1-AS1 的增强表达促进了伤口愈合能力并增加了 MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭。以上结果提示PTOV1-AS1的过表达可以触发EMT过程，促进MDAMB-231细胞的迁移和侵袭。
图 5 然后，本研究构建了针对 PTOV1-AS1 (si-PTOV1-AS1) 的 siRNA，以进一步探索 PTOV1-AS1 敲低对 MDA-MB-231 细胞伤口闭合、迁移和侵袭的作用。如图 6A-C 所示，PTOV1-AS1 的沉默导致 TJP1 和 CDH1 的上调以及波形蛋白和 SNAI1/2 在 mRNA 和蛋白质水平上的下调。同时，TGF-β1 抑制 ZO-1 的表达，而被 si-PTOV1-AS1 逆转（图 6D）。此外，PTOV1-AS1 的敲低减弱了 TGF-β1 诱导的 MDA-MB-231 细胞伤口闭合、迁移和侵袭（图 6E-F）。因此，这些结果表明，沉默 PTOV1-AS1 可以减轻 TGFβ1 诱导的 MDA-MB-231 细胞中的 EMT 和迁移。
图 6 为了检查来自 TCGA TNBC 样本的新发现亚型的稳健性，本研究使用 CCLE TNBC 细胞系中的 27 个预后 IDElncRNA 进行了层次聚类分析。根据先前综述中的乳腺癌分类，13 种 TNBC 细胞系被分为两类（4 种在 1 类，9 种在 2 类）。本研究发现脂肪酸合成相关蛋白，如 ACC1 和磷酸化 ACC（Ser79、ACC_pS79）在第 2 类中的表达显著增加，这在 TNBC 间充质亚型中也有显著表达（图 7A）。此外，DNA 修复基因 ATM 和 RAD50 在 1 类细胞系中被下调，表明 1 类细胞系中的基因组不稳定性。这些结果意味着 1 类细胞系对应于免疫亚型，2 类细胞系对应于间充质亚型，支持组织样本中基于 IDElncRNA 的分类。然后本研究调查了 24 种药物的抗癌药物反应。AZD0530、RAF265 和 Vandetanib 的药物反应在间充质细胞系中的 ActArea 值低于免疫细胞系（图 7B），间充质细胞系显示 VEGFR2 蛋白下调（图 7A）。LncRNAs的差异表达可作为潜在的药物反应生物标志物。在 TCGA BRCA 样本中，发现 18 个 IDElncRNA（17 个耐药相关和 1 个敏感性相关 lncRNA）和 2 个 IDElncRNA（1 个耐药相关和 1 个敏感性相关 lncRNA）分别与对他莫昔芬和紫杉醇的药物反应相关（图 7C、D）。由于他莫昔芬用于治疗 ER- 乳腺癌，本研究发现 7 种与他莫昔芬反应相关的 lncRNA 是luminal A 或 HER2 亚型特异性 lncRNA（图 7C）。CCLE 数据调查了 51 种乳腺癌细胞系中的抗癌药物反应，包括紫杉醇。具有下调的 ENSG00000230082 (PRRT3-AS1) 的细胞系在紫杉醇处理后显示出比具有未改变的 ENSG00000230082 的细胞系更低的 ActArea 值（图 7E），这与 TCGA 数据中确定的抗性作用一致。
图 7 本研究使用 LncRNA 个体化 (LncRIndiv) 方法对乳腺癌 (BRCA) 的 lncRNA 表达谱进行个体化。在评估了 LncRIndiv 的稳健性后，构建了 BRCA 的个体化差异表达 lncRNA (IDElncRNA) 配置文件，并研究了亚型特异性 IDelncRNA。乳腺癌亚型特异性 IDElncRNA 经常与蛋白质编码基因的改变同时发生，包括突变、拷贝数变异和差异甲基化。本研究进行了层次聚类来细分 TNBC，并揭示了 TNBC 的间充质亚型和免疫亚型。TNBC 免疫亚型显示出比 TNBC 间充质亚型更好的预后。LncRNA PTOV1-AS1 是间充质亚型中差异表达最高的 lncRNA。并且生物学实验证实PTOV1-AS1的上调可以下调TJP1(ZO-1)和E-Cadherin，并上调Vimentin，提示PTOV1-AS1可能促进上皮间质转化并导致TNBC细胞的迁移和侵袭。间充质亚型显示出较高比例的 M2 巨噬细胞，而免疫亚型与 CD4 T 细胞的相关性更高。免疫亚型的特征是基因组不稳定和免疫检查点基因上调，从而表明对免疫抑制药物的潜在反应。最后，药物反应分析显示 lncRNA ENSG00000230082 (PRRT3-AS1) 是 BRCA 治疗中紫杉醇的潜在耐药生物标志物。本研究不足之处在于应在 TNBC 数据集中进行进一步的独立验证，以研究未来工作中分类的稳健性。目前，没有包含所有预后 lncRNA 和配对 lncRNA 表达的公共 TNBC 数据集。在本研究中使用 TNBC 细胞系来验证结论。虽然 TNBC 细胞系是肿瘤细胞的主要模型，但缺乏免疫微环境可能会扭曲免疫系统相关 lncRNA 的表达。随着批量和单细胞测序数据的不断增加，可以进一步验证肿瘤免疫浸润的亚型和差异。
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