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ADC的糖基化偶联技术不改变抗体的结构，无需进行抗体工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突变以便进行酶连，目前拥有糖基化偶联技术的公司也有多家，包括Syniffix，康宁杰瑞和糖岭生物等，但是具体使用的酶和linker接头均有所不同。 Syniffix两酶三步技术 Synaffix BV是荷兰一家生物技术公司，专注于开发抗体偶联药物(ADC)技术以成为同类最佳（best-in-class），目前已经与13个公司有公开的技术授权，20多条公开的研发管线。 Synaffix先后与ADC Therapeutics、Mersana Therapeutics和中国信达生物、普方生物和上海美雅科等多家企业达成多项技术合作协议，将Synaffix的ADC专利技术用于开发抗体偶联药物。平均一个ADC1.25亿美元计算，该技术平台可以说是挣得盆满钵满。
图1 Synaffix合作公司 Synaffix采用两酶三步法进行糖基化修饰，第一步是用糖苷内切酶，第二步使用糖基转移酶，第三步进行毒素的偶联。
图2 Synaffix的两酶三步法 第一步：特异性酶切（糖苷内切酶） NovoEndo S是一种高特异性糖苷内切酶，可以特异性水解去除抗体Fc片段上的N型糖链 酶切反应的最佳pH值为7.4，最佳反应温度为37℃。反应条件非常温和。该酶可以将各种抗体糖型的糖苷内切酶修饰到连接到Asn297的核心GlcNAc。单克隆抗体在CH2结构域中可以采取不同形式的聚糖糖基化，例如复杂型、杂交型或高甘露糖型。每个糖基化谱都可以用特定的内切糖苷酶修剪到核心GlcNAc。
第二步：特异性酶连接（糖基转移酶） 利用突变的半乳糖基转移酶GalT（Y289L）连接一个叠氮修饰的GalNAc类似物UDP-GalNAC-N3在糖基转移酶的作用下将UDP-GalNAC-N3的单糖部分转移至GlcNAC上，这个反应条件也是很温和的。
图4 UDP-GalNAz结构 核心GlcNAc的各种叠氮糖可以使用以下1–3结构，结构1是N-叠氮乙酰基半乳糖胺，结构2是6-叠氮基-半乳糖，结构3是6-叠氮化物-半乳糖醛酸。
图5 核心GlcNAc三种叠氮化学结构 第三步：偶联毒素： 将叠氮修饰的聚糖与BCN修饰的有效载荷进行无铜点击共轭，生成ADC，其中y的不同决定了最终的具体DAR值。
图6 第一步和第二步酶切酶连是合并的，适合于DAR 2, 4, 6... 抗体有两个糖基化位点，如果做DAR 1的ADC，相当于做减法，就可以将两个糖基手牵手再去偶联一个毒素。
图7 糖基化偶联DAR 1 下面简单介绍几个应用Synaffix的GlycoConnect™技术的药物。 ADCT-601 ADC Therapeutics公司正在开发的偶联物ADCT-601，ADCT-601是一款靶向AXL的ADC药物，针对AXL人源化单克隆抗体通过与PBD二聚体细胞毒素结合发挥作用。这是一种利用Synaffix公司的聚糖重塑（GlycoConnectTM）和极性间隔子（HydraSpaceTM）技术。 AXL在许多实体肿瘤（如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胶质瘤和食管癌）、血液恶性肿瘤（如急性和慢性髓细胞白血病）中高度表达。目前，登记号为NCT03700294的临床试验正在评估ADCT-601对晚期实体瘤患者的安全性和有效性研究；NCT05389462临床试验研究的主要目的是确定扩展推荐剂量 (RDE)和最大耐受剂量 (MTD),并描述 ADCT-601 单药治疗和与吉西他滨联合治疗的安全性和耐受性。。
图8 ADCT-601 XMT-1592 Mersana Therapeutics与Synaffix 的GlycoConnectTM定点偶联技术合作的XMT-1592是Mersana 是靶向NaPi2b的第二款ADC新药。
图9 XMT-1592 Mersana通过Dolaflexin platform开发的首款DAR达到10-12的Napi2bADC XMT-1536 的I期临床研究报告了令人担忧的毒性问题，48%出现治疗相关性SAE，包括胃肠梗阻，发热，肺炎和腹痛。44%的病人因为治疗相关性毒性需要进行药物暂停，减量或者治疗中断。尤其是在高剂量组出现高频的肝功能异常，和肺炎，同时发现量效关系呈相反趋势，低剂量组的ORR 更高。 在临床前模型中，XMT-1592 在0.1mg剂量下表现是优于XMT-1536的。
目前XMT-1592的1/2期临床（NCT04396340），一项针对高级别浆液性卵巢癌和非小细胞肺癌的研究,旨在评估抗体-药物偶联物 (ADC) XMT-1592 的安全性和临床活性。 MRG004A 上海美雅珂与Synaffix分别与2019年4月、2020.1月达成2个ADC的GlycoConnect定点偶联技术和HydraSpaceTM极性间隔技术合作协议。
图11 MRG004A linker-payload部分结构 该项技术对偶联部位具有精准控制，可以降低药物在血液循环中脱落风险和毒性，具有更宽的治疗窗口。在临床前研究中，MRG004A已经在携带Kras G12V突变的胰腺癌及卵巢癌等多个动物模型中表现出显著的抗肿瘤活性，显示出了较好的临床应用潜力。
图12 MRG004A临床前体内药效 2018 年 7 月， 乐普生物通过收购上海美雅珂。2021年4月13日，乐普生物子公司美雅珂登记了MRG004A的美国1/2期临床（NCT04843709），一项开放标签、多中心、I/II 期剂量递增和扩展研究,以评估 MRG004A 在组织因子阳性晚期或转移性实体瘤患者中的安全性、耐受性、抗肿瘤活性和药代动力学。 IBI343 2021年6月，信达生物与Synaffix B.V.公司签订了一项非排他性的、针对特定靶点的许可协议。根据协议条款，Synaffix B.V.公司将提供专有抗体偶联药物(ADC)技术来帮助前者，基于自有抗体快速开发出具有同类最优潜力的ADC候选分子。可以改善ADC稳定性、增加有效载荷溶解度、提高偶联的效率和速度。 IBI343是重组人源抗CLDN18.2 ADC，与表达CLDN18.2的肿瘤细胞结合后，可发生CLDN18.2依赖性ADC内化，并释放毒素药物引起DNA损伤，导致肿瘤细胞凋亡。游离的毒素药物也可以通过质膜扩散到达并杀死相邻的肿瘤细胞，因此IBI343也具有旁观者效应（bystander effect）。目前IBI343在澳大利亚进行临床1期研究（NCT05458219），以评估IBI343在晚期实体瘤受试者中安全性、耐受性和初步有效性，并确定最大耐受剂量（MTD）和/或II期推荐剂量（RP2D）。
图13 IBI343结构设计和特征 康宁杰瑞一酶两步技术 康宁杰瑞和糖岭生物采用类似的糖基偶联技术，均采用单酶催化法，相较于Synaffix平台操作更简便，步骤也更简短。 JSKN003 JSKN003为新型靶向HER2双表位的抗体偶联药物（ADC），由康宁杰瑞利用特有的糖定点偶联平台自主研发：将抗体分子KN026重链糖基经过点击化学反应获得DAR值约为4的定点修饰抗体偶联物。JSKN003能够结合肿瘤细胞表面的HER2，通过HER2介导的细胞内吞释放有效载荷，发挥抗肿瘤作用。
JSKN003目前临床剂量爬坡至5.2mg/kg（2mg/kg是起效剂量，未来计划爬坡至10mg/kg），未出现3级以上副作用，参考DS8201在4mg/kg（起效剂量）爬坡至8mg/kg时就出现了3级不良反应。相较DS8201，有望通过更高剂量给药实现更优，或同等剂量安全性胜出。
图15 康宁杰瑞JSKN003药物特点和临床策略 糖岭生物一酶一步&一酶两步技术 糖岭生物是由中国科学院上海药物研究所黄蔚教授团队发明的糖定点ADC偶联技术。根据设计linker的不同，黄蔚老师的文章中有一酶一步和一酶两步的策略。
图16 黄蔚老师的一酶一步&一酶两步技术 糖岭生物的糖基化偶联技术叫“DisacLink”技术，只用一种酶，反应时间短，偶联率高且稳定。 反应条件温和。接近中性的pH，无需高温或有机溶剂。并且也有ADC定点偶联试剂盒的开发，相当于“一锅法”反应，操作便捷，有DAR 2和4两种选择。
图17 糖岭生物与synaffix糖基化偶联对比 黄蔚曾在美国马里兰大学任研究助理和助理教授，师从Lai-Xi Wang，Lai-Xi Wang课题组主要研究方向就是低聚糖、糖脂和糖蛋白的化学酶合成以及抗体的位点特异性糖工程和功能研究，可见黄蔚老师是延续了之前课题组的工作，并成功成立自己的公司将其商业化。
图18 Lai-Xi Wang课题组照片
图19 Lai-Xi Wang课题组的一步偶联法 |
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