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NA测序（RNA-Seq）是基于二代测序技术开展转录组学研究过程中广泛使用的一种方法，能够在特定时间点对生物样本中的多种RNA进行定性和定量分析。针对RNA测序的常规建库方法都需要先将RNA转换为双链DNA，且需经过目标RNA富集及片段化、双链DNA合成、接头连接、PCR扩增等多个步骤。
Tn5转座酶复合体因能一步打断双链DNA并且使DNA两端带上接头，而广泛应用于二代测序建库等领域。近期也有研究发现，Tn5转座酶同样能以类似的方式作用于RNA/DNA杂合链，从而能够省去传统RNA建库技术中的RNA片段化、二链合成等繁琐的操作步骤，进一步拓展了Tn5转座酶的新用途。此外，Tn5转座酶也被广泛用于体外转基因(外源基因整合到宿主细胞)等各领域。
NGS™ Tn5转座酶是一种来源于E.coli、经过改造具有极高活性的Tn5转座酶突变体，可以高效地将Tn5转座子随机插入到目标序列，对于真核和原核生物的DNA都有极高的转座插入效率。与野生型Tn5转座酶相比，其插入效率至少提升1000倍，具有转座随机性好、稳定性高、插入位点易测序等特点。
产品原理：
本产品可以特异性识别两端含有嵌合末端序列(Mosaic End sequence, ME)的DNA片段(包括含有ME序列的引物)，最终形成Tn5转座体，该转座体可以随机结合靶DNA并切割插入其携带的DNA片段。
图1. NGS™ Tn5 Transposase的工作原理图。
产品用途：
二代测序(NGS)文库构建时的片段化和加接头；
将测序引物引入克隆DNA或质粒；
细菌基因敲除库的建立；
新型细菌菌株工程改造；
目的基因的插入失活；
将T7转录启动子、抗性标记等插入靶DNA等。
使用说明：
1.体外转座子插入反应和转化。
a.Tn5转座子的设计。Tn5转座子是两侧带有19bp ME序列的DNA片段，可以使用含有ME序列的上下游引物进行PCR合成。为了获得最佳的转座效率，在两端的PCR引物中需要添加一个5'磷酸基团。典型的Tn5转座子参考图2。
ME序列: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
图2. Tn5转座子示意图。Tn5转座子其两端为19bp ME序列，ME序列可被BeyoNGS™ Tn5转座酶特异性识别。
b.按照下表制备转座子插入混合物。配制过程中需要注意目标DNA纯度，确保无外源核酸污染。
| Component |
Volume |
| Reaction Buffer (5X) |
2μl |
| Target DNA* |
0.2μg |
| molar equivalent Tn5 Transposon |
x μl |
| BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) |
1μl |
| ddH2O |
To 10μl |
*注：为了避免多余片段的插入，需要计算反应中使用的目标DNA摩尔数，并加入等摩尔量的Tn5转座子片段以减少产生过多插入的可能性。μmol target DNA=μg target DNA/[(base pairs in target DNA)×660]，例如：0.2μg 5000bp的目标DNA = 0.2μg/ [5000bp×660]=0.06×10-6μmol = 0.06pmol。
c.混匀后37℃孵育2小时。
d.加入2μl Stop Buffer (5X)，混匀后55℃孵育10分钟终止反应。
e.取1μl混合物电击转化到感受态细胞中，根据抗性标记筛选阳性菌株。未使用的混合物可以-20℃保存。推荐的电击转化条件：50μl感受态细胞，1μl混合物，2毫米电击杯，2500V，电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
2.BeyoNGS™ Tn5转座体复合物( BeyoNGS™ Tn5 Transposome complex)的构建和转化后的体内插入。
a.按照下表依次加入相应试剂，制备Tn5转座体复合物混合物。
| Component |
Volume |
| Tn5 Transposon DNA (100μg/ml in TE Buffer) |
2μl |
| BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) |
4μl |
| Glycerol (100%) |
2μl |
| Total Reaction Volume |
8μl |
注1：本反应无须Mg2 催化，请勿使用D7102-2 Reaction Buffer (5X)。
注2：参考1a中Tn5的转座子设计，Tn5 Transposon DNA为含选择标记(如抗性标记)、成对识别序列(如ME序列)和目标基因的双链DNA，可通过PCR等方法获得。
注3：本反应体系可根据实际需要进行放大或缩小。
b.混匀后室温孵育0.5-1小时。
c.取1μl的转座体复合物电击转化到感受态细胞中，在体内进行插入，并根据抗性标记筛选阳性菌株。推荐的电击转化条件：50μl感受态细胞，1μl转座体复合物 ，2毫米电击杯，2500V，电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
d.构建好的转座体复合物-20℃可以保存1年。
3.构建二代测序所需的BeyoNGS™ Tn5转座体( BeyoNGS™ Tn5 Transposome)。
a.ME和接头(Adapters)的序列。
ME: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
Primer 1: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
Primer 2: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
注：本接头序列参考Nextera® DNA Sample Preparation Kit (Illumina, FC-121-1030)，也可按照不同高通量测序的要求进行设计。
b.制备Adapter 1和Adapter 2。
按照下表分别配制Adapter 1和Adapter 2退火反应体系。退火反应后Adapter 1或Adapter 2的终浓度为200μM。
| Component |
Volume |
| Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251) |
10μl |
| ME (500μM) |
20μl |
| Primer-1 or 2 (500μM) |
20μl |
| Total Reaction Volume |
50μl |
在PCR仪设置退火反应程序：
| Step |
Temperature |
| 1 |
95℃, 2min |
| 2 |
95℃, 8s, -0.1℃ per cycle |
| 3 |
GOTO step 2, 700 cycles |
| 4 |
4℃ forever |
c.BeyoNGS™ Tn5转座体的制备。
按照下表，将BeyoNGS™ Tn5转座酶、Adapter 1和Adapter 2尔比1:0.5:0.5混合，吹打混匀，室温孵育1小时。注：可根据实验需要适当提高Tn5转座酶的混合比例，但Adapter 1和Adapter 2的浓度需要保持一致。制备好Tn5转座体可直接用于DNA片段化实验，也可以-20℃保存。
| Component |
Volume |
| BeyoNGS™ Tn5 Transposase |
10μl |
| Adapter 1 (200μM) |
1μl |
| Adapter 2 (200μM) |
1μl |
d.片段化(Tagmentation)效果测试。
按照下表配制反应体系，轻轻吹打混匀后，55℃孵育5-10分钟。随后加入5μl Stop Buffer (5X)，混匀后55℃孵育5分钟终止反应，片段化的产物可用于检测或纯化后建库, 效果参考图3。根据打断片段的大小调整复合体用量，如果片段过长，增加转座体的使用量；如果片段过短，则减少转座体的使用量。
| Component |
Volume |
| DNA |
50-100ng |
| Tn5转座体 |
0.5-2μl |
| Reaction Buffer (5X) |
4μl |
| ddH2O |
To 20μl |
图3. 使用NGS™ Tn5 Transposase制备的Tn5转座体用于DNA随机片段化的效果测试图。在20μl反应体系中，加入100ng Lambda DNA及相应量的Tn5转座体，55℃孵育10分钟，反应完毕入5μl Stop Buffer (5X)，混匀后55℃孵育5分钟终止反应，加入5μl DNA上样缓冲液(6X) ，使用 琼脂糖预制胶进行电泳检测。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
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