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载体构建(vectorconstruction)是把连接好的DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体，当给质粒插入一段外源DNA段后，它依然能够进行自我复制。 一、质粒 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： （1）是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 （2）能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。 二、载体类别 1.按功能划分 （1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。 （2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的 DNA顺序的载体。 2.按进入受体细胞类型划分 （1）原核载体 （2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间），穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。 三、常用质粒载体 pBR322 DNA是是研究得最多、使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一，该载体长度为4361个碱基，pBR322为氨苄青霉素和四环素抗性，可以用于基因克隆，有时也被用于制备DNA分子量标准。 质粒载体pBR322符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体pBR322具有以下特点： （1）相对分子质量较小，载体长度为4361bp。 （2）带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。 （3）具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记。 （4）具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 四、载体构建过程 1、引物设计 2、目的片段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化 3、双酶切 4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接 5、转化 6、菌落PCR 7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)比对 ； 8、菌种保存：菌种比对成功，则可保存菌种备用。 9、质粒提取：菌种比对成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒。 在载体家高度优化的克隆平台上，一般的表达载体使用Gateway克隆和Gibson组装等方式构建，而shRNA和gRNA载体则使用基于直接连接的方式构建。 |
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