文献分享【第七十四期】：靶向PPAR-γ抵消肿瘤对肝细胞癌免疫检查点阻断剂的耐药

外科黄文斌 2023-06-07 发布于广东

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题目：Targeting PPAR-gamma counteracts tumour adaptation to immune-checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma

期刊：Gut

发表时间：2023.03

通讯作者：Alfred Sze-Lok Cheng（郑诗乐）

作者单位：香港中文大学

引言

免疫检查点阻断治疗（ICB, Immune-checkpoint blockade）是包括肝癌在内的实体肿瘤的只要治疗手段。然而，免疫抑制肿瘤微环境(TME)形成抑制了细胞毒性T淋巴细胞浸润，从而限制了ICB对少数HCC患者的反应性。值得注意的是，最近的一项前沿III期试验结果表明，采 PD-L1抑制剂 atezolizumab 和抑制血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体 bevacizumab 联合ICB治疗可通过调节免疫微环境而提高肝癌患者的缓解率。然而绝大部分肝癌患者对。尽管取得了这一突破，但由于原发性或获得性耐药，很大比例的HCC患者仍然不能从这种新的治疗方案中获益。肿瘤细胞中 PD-L1 上调介导的适应性耐药，以及由此导致的肿瘤微环境中 T细胞功能障碍，是一种经典的肿瘤免疫逃避机制。鉴于肿瘤-免疫相互作用的进化性质，肿瘤适应性免疫反应可能在临床上表现为对PD-L1 / PD-1 阻断的获得性或原发性耐药。然而，我们对癌细胞对于 ICB治疗诱导的免疫攻击的适应性几抵抗的理解仍然不完整，特别是在HCC 肿瘤微环境中。在此项研究中，香港中文大学Alfred Sze-Lok Cheng 教授团队通过连续对肝癌原位癌模型进行抗PD-L1 治疗得到治疗不同阶段的样本，并利用单细胞测序对肿瘤微环境进行分析。揭示了一种肿瘤适应性转录程序，该程序通过免疫抑制肿瘤微环境重塑逃避PD-L1/ PD-1 阻断的治疗压力。我们进一步证明，共同靶向新出现的过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)信号可以避免多种原位和自发性 HCC 模型中的 ICB 耐药性。此项研究将为阻断 HCC 细胞特异性免疫逃逸途径提供精准癌症免疫治疗的新策略。

研究结果

1、HCC细胞在连续接受 ICB 治疗后获得免疫逃避能力

作者首先通过连续C57BL/6 肝癌原位瘤模型进行连续抗 PD-L1 治疗6-7个周期建立 PD-L1 敏感型肝癌细胞 PD-L1S 及 PD-L1 耐药型模型肝癌细胞 PD-L1R。PD-L1R肿瘤的生长明显大于PD-L1S 肿瘤。然而，PD-L1R 和 PD-L1S HCC细胞在免疫功能低下的裸鼠中表现出相似的肿瘤重量。证明肝癌细胞对 ICB治疗的适应型并不是由于肿瘤细胞本身增殖能力增强导致的。且与 PD-L1S肿瘤相比，PD-L1R 肿瘤组织中CD4 T辅助1 (TH1)细胞和 CD8 T细胞比例明显下降，同时骨髓源性免疫抑制细胞MDSCs 比例增加，PD-L1R 肿瘤中 CD8 T 细胞的功能明显下降。这些数据提示PD-L1R HCC 细胞在ICB治疗压力下通过重塑免疫微环境，PD-L1R 荷瘤小鼠血液和脾脏中一致的CD8 T 细胞减少和 PMN-MDSC 诱导提示抗 ICB 肿瘤可引起全身免疫抑制。利用单细胞测序对肿瘤微环境分析结果显示与流式细胞术的结果相似，免疫微环境 PD-L1R 肿瘤含有相对较少的T/NK淋巴细胞，但比PD-L1S肿瘤含有更多的 MDSCs 细胞。

Figure 1 HCC cells acquire immune evasion capability in ICB-resistant orthotopic mouse models.

2、PPARγ的适应性上调协调TME重塑抵抗ICB疗法

单细胞测序数据分析显示ICB敏感及ICB抵抗的肿瘤细胞表现出不同的转录图谱，通路富集分析发现差异基因主要富集与PPAR通路，且PPARγ在两个耐药细胞系中均高表，且与CD8 T细胞功能失调及预后不佳明显相关。此外，肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)分析结果显示PPARγ高表达更易产生ICB治疗抵抗。同时PPARγ高表达具有更高的MDSC评分。因此，作者推断抑制PPARγ可能改善抗肿瘤免疫反应并导致肿瘤对ICB治疗重新敏感。为了验证这一点，我们建立了PPARγ-敲低(KD)的PD-L1R耐药细胞株。与耐药细胞株相比，shPPARγ细胞的致瘤能力及对于ICB治疗的敏感性明显下降。同时抑制PPARγ和PD-L1显著增加瘤内总CD8 T细胞和细胞毒性CD8 T细胞水平，减少了耗尽的CD8 T细胞和PMN-MDSCs。且MDSCs细胞浸润与细胞毒CD8 T细胞的数量及比例呈明显负相关。

Figure 2 Adaptive upregulation of PPARγ correlates with immune dysregulation in mouse models and patients with HCC

Figure 3 Tumour-intrinsic PPARγ orchestrates TME remodelling to resist ICB therapy.

3、肿瘤固有的PPARγ转录激活VEGF-A的产生以重塑肿瘤微环境

PMN-MDSCs与耗竭型CD8 T细胞明显呈正比，提示我们推测有一种分泌因子介导PPARγ对TME的重塑。通过对单细胞数据分析，最终确定VEFG-A与PPARγ的转录明显相关。敲低PPARγ的肿瘤细胞内VEGF-A的mRNA及蛋白水平均明显下降，PD-L1R肿瘤细胞中PPARγ的KD也显著降低了其在VEGF-A启动子上的占用，与PD-L1S肿瘤细胞的水平相似。因此VEGF-A被确定为PPARγ在肝癌细胞中的直接靶点。为了进一步探讨VEGF-A在肿瘤中的作用，作者进行了体外共培养试验。在PPARγ-KD或对照PD-L1R肿瘤细胞条件培养基(CM)中，结果显示小鼠骨髓细胞PMN-MDSCs在PPARγ-KD的CM培养显著减少。同时，VEGF-A可完全恢复了PMN-MDSC的扩增和Arg-1的表达。以上结果表明PPARγ激活可促进MDSCs细胞增殖。在利用肿瘤细胞条件培养基共培养的实验中， PPARγ-KD肿瘤细胞显著降低了PD-1和TIM-3的表达，但增加了CD8 T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达。同时VEGF-A也可显著降低细胞毒T细胞的比例，提示PPARγ以VEGF-A依赖性的方式损害CD8 T细胞的抗肿瘤功能。

Figure 4 Tumour-intrinsicPPARγ transcriptionally activates VEGF-Aproduction to remodel TME.

4、PPARγ拮抗剂可抑制多种HCC模型中的ICB耐药

上述实验中，PPARγ被证明在肿瘤ICB耐药中具有重要的作用，在后续的实验中，该研究团队评估了PPARγ抑制剂T0070907在肿瘤治疗中的疗效。虽然在耐药模型中，单独使用PPARγ拮抗剂治疗对肿瘤负荷的影响有限，但当T0070907治疗与ICB联合使用时，肿瘤生长基本上被消除。T0070907 也可显著降低肿瘤细胞VEGF-A的表达水平同时逆转抑制性免疫微环境。考虑到肿瘤异质性及肿瘤细胞与肿瘤免疫治疗间复杂的相互作用机制，利用肿瘤原位模型并不能模拟肿瘤免疫监视，因此该研究团队进一步在自发肿瘤模型中进行进一步验证。在持续尾静脉注射HDTVi构建的肝癌模型中进一步进行持续性ICB治疗，最终构建出PD-L1耐药肿瘤模型。进一步进行抗肿瘤治疗，结果显示T0070907能使自发肿瘤对抗PD-L1治疗恢复反应性。与肿瘤VEGF-A水平降低一致，免疫分析显示PPARγ抑制显著缓解T细胞排斥和减少了MDSCs富集， PD-L1共阻断进一步提高CD8 T/PMN-MDSC和细胞毒性/耗尽CD8 T细胞比例。以上结果证实抗PD-L1及PPARγ抑制联合可有效克服ICB抗性并介导肿瘤微环境正常化。

Figure 5 PPARγ antagonist T0070907 averts ICB resistance in orthotopic HCC models.

Figure 6 PPARγ antagonist T0070907 overcomes ICB resistance in the spontaneous HCC model.

5、 ICB耐药的HCC患者表现PPARγ激活及免疫抑制微环境的形成

该研究团队进一步在参加PD-1抗体pembrolizumab相关临床试验（NCT03419481）的病例中进行分析。并利用单细胞测序技术对持久获益患者（DCB）及无持久获益患者(NDB)进行分析。NDB患者在ICB治疗中显示PPARG上调。为了进一步验证了PPARγ的蛋白表达及其与免疫细胞的关系，作者对 NDB患者的活检标本进行了免疫荧光分析，结果显示PPARγ和CD11b/CD15（PMN-MDSCs 的标志物）阳性率更高。CD8阳性率较低。与体外和体内的研究结果相一致，PPARG和血管内皮细胞之间存在着明显的相关性。