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影响因子：10.19 研究概述： 本研究旨在通过将单细胞技术与普通转录组测序的预后数据相结合，开发临床有效的基因对特征（GP特征）以评估胶质母细胞瘤GBM患者的预后，并研究肿瘤相关免疫与GP特征之间的关系，为指导临床实践提供参考。 重点的研究结果包括：GP特征可以预测胶质母细胞瘤和泛癌的预后，与免疫多样性和肿瘤特征有关，可以反映免疫治疗的有效性；高GP评分与先天免疫细胞的强烈浸润相关，高GP评分的恶性细胞与免疫细胞具有很强的细胞相互作用。
研究结果： 一、胶质母细胞瘤单细胞转录组学景观 1. 首先整合8953个细胞(33个人原代GBM组织)的单细胞RNA测序数据，进行生物信息学分析(图1A)。 2. 染色体CNVs是癌症遗传改变的有效形式之一，作者通过染色体CNVs鉴定了GBM的恶性和非恶性细胞，将11个细胞集群进行了分类(图1B、C、D)。
3. 图1E描绘了GBM单细胞维度上的染色体CNVs，绝大多数GBM恶性细胞表现为典型的7号染色体扩增和10号染色体缺失。恶性细胞和非恶性细胞的染色体拷贝数变化存在显著差异：与非恶性细胞相比，恶性细胞基因组的许多区域丰度过高或过低。 4. 图1F的差异分析鉴定出224个恶性细胞中的上调基因以供进一步分析。
二、与预后相关的新基因对标记的鉴定和建立 构建预测模型的过程如图2A所示。首先利用3013个胶质瘤样本的转录组数据和相应的预后数据，通过单变量Cox回归分析，从恶性细胞中上调的224个基因中筛选出39个显著影响GBM患者OS的基因。随后利用39个预后相关基因组成基因对，鉴定出38个预后相关基因对(有一组基因对重复)，共55个基因。
三、GP特征可以预测胶质母细胞瘤和泛癌的预后 1. 作者计算了每个样本的GP分数，并使用“maxstat”（最大选择秩统计）统计量来确定连续变量的最佳临界值，将样本分为高或低GP分数组，比较两组的临床预后。 2. TCGA、CGGA和GEO的每个胶质瘤数据集的生存分析曲线(图2B)可见，高GP评分组的胶质瘤、GBM和LGG患者的总生存率低于低GP评分组。 3.对其余15种恶性实体瘤进行泛癌研究以检验GP特征的普遍性：一般来说，高GP评分与较差的预后有关(图2C)。时间依赖性ROC曲线表明GP特征在GBM和胶质瘤中具有良好的预测能力(图2D)。
4. 胶质瘤样本中单因素cox危害分析（图2E）表明，高GP评分是一个危险因素。 5. 在TCGA泛癌样本中进行了单变量Cox风险比例模型分析（图2F），一般来说，高GP评分是预后不良的危险因素。细分到特定肿瘤则：在BLCA，KIRC，SKCM和UCEC中，高GP评分是预后的危险因素，而在BRCA，COAD，LUAD和READ中，高GP评分是保护因素。
四、GP特征中基因组和甲基化改变的不同模式 1. 基于TCGA衍生的GBM全基因组测序数据进行了染色体CNVs、体细胞突变分析和全基因组甲基化分析。 拷贝数分析(图3A)表明，高低GP评分组的共同得失频率相似，包括7p11.2扩增峰和9p21.3缺失谷。在高GP评分组中两种变异常同时发生，而低GP评分组少见两种变异同时出现。
2. 体细胞突变分析（图3B，C）显示，高GP评分组中磷酸酶和紧张素同源物（PTEN）（31%）、Titin（TTN）（29%）和EGFR（29%）的突变显著富集。 低GP评分组中观察到肿瘤蛋白p53（TP53）（52%），PTEN（31%）和α地中海贫血/智力迟钝综合征X连锁（ATRX）（27%）突变频率较高。
3. DMP分析（图3D）表明两个GP评分组的甲基化位点不同，高GP评分组总体表现出低甲基化趋势，低GP评分组则相反。 4. DMP相关基因的GO富集分析（图3E）表明，高甲基化基因对免疫相关生物过程具有更重要的贡献，如抗原加工和呈递，单核细胞分化的正调控，树突状细胞分化的调控以及对肿瘤细胞的免疫应答。
五、GP评分高的胶质母细胞瘤具有较强的恶性生物学特征 1. GSEA和GSVA通过分析单细胞测序数据（图4A，B）表明，高GP评分的恶性细胞表现出更强的肿瘤相关免疫调节。免疫相关信号通路在高GP评分的恶性细胞中富集，特别是与先天免疫相关的信号通路。 2. 基于先前的研究，GBM具有四种中枢细胞状态：神经祖细胞样（NPC样），少突胶质细胞祖细胞样（OPC样），星形胶质细胞样（AC样）和间充质样（MES样），作者发现AC和MES样的恶性细胞GP评分高，而OPC和NPC样的恶性细胞GP评分低（图4C，D）。
3. 由于各种细胞类型是转录因子与其相应靶基因复杂协调的产物，作者利用系统的基因调控网络（图4E）探索了恶性细胞转录因子之间的相互关系。 高GP评分的恶性细胞的关键调节因子包括NFE2L2，TGIF1_extended和CEBPD。 低GP评分的恶性细胞中存在HOXA9_延长，HMX1和LHX1_延长。
4. （图4F）用调控子的连接特异性指数(CSI)来描述不同调控子与调控子之间的关联，具有较高指数的调控因子可以共同调节下游基因并共同负责细胞功能。根据CSI将监管子类分为四个主要模块。 5.（图4G）高GP评分组在模块4和模块3中有更多的调节子计数，低GP评分组在模块1和模块2中具有更多的调节子计数，说明不同GP评分的GBM细胞中存在差异转录调控关系。
6. (图4H) 肿瘤组织中含有不同发育阶段的细胞，伪时间分析展示了GP评分随伪时间变化的细胞轨迹图的四个分支。GP评分高的细胞主要分布在分支树的根节点附近，可能更具有肿瘤干细胞的特征；GP评分低的细胞主要分布在分支树的末端，更容易分化到终末期。 六、高GP评分与免疫相关途径的激活高度相关 1. 来自GO，KEGG和Hallmark数据集的基因集的GSVA显示，肿瘤相关信号通路以及免疫相关信号通路随着GP评分的增加而逐渐激活(图5A)。
2. GSEA进一步显示(图5B)，肿瘤相关通路在高GP评分组中富集，高GP评分组中巨噬细胞、NK细胞、T细胞、B细胞活化等免疫相关通路和IL-6-STA T3信号通路也富集，提示高GP评分与GBM肿瘤免疫浸润高度相关。 3. 泛癌的GSVA分析（图5C）结果类似：大多数免疫相关和肿瘤相关信号通路与几种恶性实体瘤的GP评分高度相关。
七、胶质母细胞瘤GP特征与免疫特征的相关性分析 1. 基于TCGA和CGGA衍生的GBM样本进行免疫浸润分析，如图6A、B，随着GP评分的变化，TME和高GP评分组中浸润免疫细胞成分的变化表现出更明显的免疫浸润，尤其是先天免疫细胞：巨噬细胞(特别是M2巨噬细胞)、调节性T细胞（Tregs）和浆细胞样树突状细胞（pDC）等。
2. 使用CIBERSORT和免疫浸润ssGSEA分析来处理TCGA胶质母细胞瘤数据集（补充图8）。一般来说，高GP评分组的免疫细胞比例高于低GP评分组，提示GP评分的差异与GBM的TME密切相关。
3. 细胞溶解活性(CYT)是一种重要的预后数据生物标志物，可为评估胶质瘤中免疫微环境和免疫检查点提供潜在指标。如图6C，高GP评分组的CYT程度高于低GP评分组，且CYT程度与GP评分呈正相关。 4.在图6D中，高GP评分组的T细胞发炎基因表达谱（GEP）水平（一种可能有助于识别在广谱癌症中对免疫治疗产生反应可能性更高的患者的生物标志物）高于低GP评分组。GEP程度与GP评分呈正相关。虽然CYT评分、GEP评分和GP评分之间的关系有统计学意义，但相关系数较弱，表示可能存在潜在的关联。
八、GP评分高的恶性细胞与免疫细胞具有很强的细胞相互作用 1.图S9探索了恶性和非恶性细胞之间细胞间通讯的差异，根据细胞表面受体或配体，模块化聚类分析表明，GBM微环境中各类细胞的发送和接收信号模式分为五类，高GP评分的恶性细胞的发送和接收信号模式不同。
2. 在GBM微环境中的膜联蛋白和LT信号通路中，高GP评分恶性细胞作为重要的发送者和影响者与先天免疫细胞进行通信。相比之下，低GP评分的恶性细胞影响不太大（图6E，F）。 3. 在CD30信号网络中，高GP评分的恶性细胞与巨噬细胞一起作为Tregs信号的受体和影响者。（图6G）。
九、胶质母细胞瘤GP评分与免疫治疗的相关性分析 1. 探索高低GP评分组之间免疫检查点分子的差异表达（图S10A、B），发现具有高GP评分的组织表现出大多数配体分子的上调表达和更高的受体表达。
2. 比较HLA同种异型在两组之间的分布，发现高GP评分组表达更多的HLA同种异型，这表明HLA可以帮助GP特征预测GBM的免疫状态(图S10C)。 3. GP高评分组的样本除了信号淋巴细胞激活分子家族成员(SLAMF) 7外，所有选定的共抑制分子都过表达(图S10D)。 4. 共刺激分子诱导型T细胞共刺激配体(ICOSLG，免疫调节配体B7家族的成员) 在高GP评分组中显著过表达，与GBM患者预后不良相关(图S10E)
十、湘雅医院队列基因对特征的综合评估 1. 图7A，B使用术后病理标本的转录组测序数据并结合其相应预后信息，发现高GP评分患者在GBM和胶质瘤队列中的结局较差，与之前结论一致。 2. 之前有研究发现，高GP评分样本的TME中先天免疫细胞，尤其是巨噬细胞的比例高于低GP评分样本。图7C、D通过多重免疫荧光分析XYNS队列GBM样本的高和低GP评分组TME中的巨噬细胞发现：低GP评分组中CD68+TSPO+细胞的表达相对较低，CD68+CD163+细胞几乎不表达；高GP评分组中CD68、TSPO和CD163的标志物显著表达。
4. 图7E使用表达数据（ESTIMATE）算法：基质、免疫和ESTIMATE评分与GP评分成正比，但肿瘤纯度与GP评分成反比。此外，大多数免疫细胞比例随着GP评分的增加而增加，表明高GP评分组具有更强烈的肿瘤免疫微环境。 5. 在免疫检查点表达方面，使用XYNS队列验证其与GP评分的关系。如图7F所示，随着GP评分的增加，抗原呈递、细胞粘附、共抑制剂、共刺激剂、配体、受体等免疫检查点分子的表达更加强烈，这与以往利用公开数据得出的结论一致。
研究总结： 本研究开发了基于样本内相对表达量的GP模型，消除了对数据标准化的需要，从而提高了可靠性和可推广性，作者还采用单细胞RNA测序数据，更好地关注肿瘤细胞特征。高GP评分与GBM的不良预后高度相关，并且该特征在各种其他恶性实体瘤的分析中表现出良好的外推性，提示GP特征可能具有广泛临床适用性预后模型的潜力。 |
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