硝酸细菌的分离培养

在污水,污泥或土壤中,有机氮化合物经氨化细菌作用,分解成氨,硝化细菌又将氨氧化成硝酸盐,此过程为硝化作用.它包括两个连续的阶段:首先,氨经亚硝酸细菌作用氧化为亚硝酸；亚硝酸又经硝酸细菌作用氧化为硝酸.亚硝酸细菌与硝酸细菌合称为硝化细菌.它们都为好氧化能自养菌.此外,还有一些异养细菌和放线菌,真菌中的某些种类,也能将氨转化成亚硝酸或硝酸.硝化细菌的分离纯化比较困难,主要是因为硝化细菌生长缓慢,而伴生的异养细菌生长迅速.在选择性较强的硅胶平板上长出的菌落很小,直径仅有100μm,分离难度很大.

亚硝酸细菌的分离培养

样品采集

作为亚硝酸细菌的分离源,可采取湖泊中的表层淤泥,沟渠软泥或城市污水厂的活性污泥.

亚硝酸细菌富集培养基:

(NH4)2S04 2g   K2HPO4   1g

MgSO4 7H20  0.5g CaCO35g

FeSO4·7H2O0.4g H2O  1000毫升

NaCl2g   pH   7.2

除CaCO3外,其余成分溶解于水中,装瓶后按0.5%的比例加入CaCO3,121摄氏度,灭菌20分钟.

若培养硝酸细菌,则以KNO2  2g代替(NH4)2S04.

亚硝酸细菌富集培养

目的是大量淘汰异养细菌,增加亚硝酸细菌的菌数.具体方法如下:

取泥样0.5至1g,投加于富集培养液中,混匀,置于28摄氏度下培养2至3天后,开始检测NO2-盐的生成,通常在7天左右NO2-盐大量出现.

当检出NO2-盐后,取0.1毫升富集培养液接种到新鲜的富集培养基中,继续培养并检测NO2-盐.

经7次重复富集培养后,开始连续供给能源,即每隔3至5天,添加5%硫酸铵溶液2至3毫升,并加入适量碳酸钙.

硅胶平板培养基的制备

将硅酸钾或硅酸钠配制成比重为1.10的溶液,过滤澄清.取比重为1.09的盐酸,与等体积的上述溶液混合.操作时将硅酸钠缓慢加入盐酸内,搅拌均匀,倒入培养皿内.每皿20至25毫升,静置24小时,待凝固成平板后用缓流水冲洗2至3天,以除去氯离子,直至Cl-完全消失.滴加1%硝酸银溶液测试,如呈白色,表明有Cl-需继续冲洗.冲洗后的平板用煮沸的蒸馏水冲洗三次以灭菌.或用紫外线照射灭菌.操作时将培养皿置于距紫外灯2m处,照射30分钟,皿盖置于一边同时灭菌.然后,在每个硅胶平板上加亚硝酸菌富集培养基2毫升和5%(NH4)2S04 溶液1毫升.轻轻转动培养皿,使培养液分布均匀.打开皿盖在50摄氏度烘箱内烘至平板无水流动为止.

亚硝酸细菌的分离纯化

用无菌吸管吸取0.1至0.2毫升富集培养液,接种到上述制成的硅胶平板上.用无菌玻璃推棒将菌液均匀涂布在平板上.置于底部盛水的干燥器内(防水分蒸发,免使平板干裂),在28至30摄氏度下培养15至30天.当硅胶平板出现亚硝酸细菌菌落后,挑起菌落再接种到液体培养基中,通过测定NO2-的生成来确定亚硝酸细菌的增殖情况.同时,取少量培养物接种到肉汤蛋白胨培养基中,如观察到培养液中有异养细菌生长,则必须重复以上的纯化分离操作.也可用接种环挑取富集培养液,点种于硅胶平板分离培养基表面.在皿盖上放一张湿滤纸或如前法培养.由于硅胶平板有高度的选择性,在点样周围的菌落均是亚硝酸细菌.

硝酸细菌的分离培养

取污泥或土壤少量,分别接种于硝酸细菌富集培养液中,混匀,30摄氏度培养.在富集培养时要连续供给5%亚硝酸铵溶液数毫升,以代替硫酸铵,也有利于抑制其他菌的繁殖.

硝酸细菌的分离纯化方法,原则上与亚硝酸细菌相同,可采用硅胶平板法.但在硅胶平板上要加5%亚硝酸铵溶液1毫升以替代硫酸铵溶液,还要投加硝酸细菌培养基2毫升.培养后,在硅胶平板深层形成针头状菌落.也可利用硝酸细菌富集培养基中投加1.5至2%琼脂,制成固体平板,用此平板进行分离纯化.

亚硝化菌培养基 (NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO4·7H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO4·7H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水1000毫升 PH 自然固体培养基加5％琼脂

硝化菌培养基 NaNO2 1g MgSO4·7H2O 0.03g MnSO4·4H2O 0.01g K2HPO4 0.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸馏水1000毫升 PH 自然固体培养基加5％琼脂 

硝化作用测定  

试剂 

格利斯试剂溶液Ⅰ:称取磺胺酸0.5g,溶于150毫升醋酸溶液(30％)中,保存于棕色瓶中. 溶液Ⅱ:称取α-萘胺0.5g,加入50毫升蒸馏水中,煮沸后,缓缓加入30％的醋酸溶液150毫升中,保存于棕色瓶中. 

2%醋酸钠溶液 将2g无水醋酸钠加入到100毫升蒸馏水中,混匀溶解. 

1.2.4.2 方法  

标准曲线的绘制 

称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中,加蒸馏水溶解后洗入100毫升容量瓶中,加蒸馏水至刻度定容,摇匀,溶液中NO2-的浓度为30mg/毫升,用时稀释至NO2-为0.03 mg/毫升.  

吸取NO2-标准液(NO2-0.03 mg/毫升)0,1,2,3,4,5 毫升,分别放入50 毫升容量瓶中,每一容量瓶NO2-浓度为0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0μg/毫升；各加入1 毫升格利斯试剂Ⅰ,放置10分钟,再加入1 毫升格利斯试剂Ⅱ和1毫升2％醋酸钠溶液,显色后稀释至刻度.  

用分光光度计于520nm处比色,以浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制标准曲线.  

培养液中NO2-测定  

亚硝化菌氨转化作用测定 取1 毫升培养液于50 毫升容量瓶中,加入1 毫升格利斯试剂Ⅰ,放置10分钟,再加入1 毫升格利斯试剂Ⅱ和1毫升2％醋酸钠溶液,显色后稀释至刻度.用分光光度计于520nm处比色. 

硝化菌硝化作用强度测定 取1 毫升培养液稀释100倍(视培养液中NO2-浓度而定),取稀释后的培养液1 毫升于50 毫升容量瓶中,加入1 毫升格利斯试剂Ⅰ,放置10分钟,再加入1 毫升格利斯试剂Ⅱ和1毫升2％醋酸钠溶液,显色后稀释至刻度.用分光光度计于520nm处比色.  

结果计算 

标准曲线以浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制标准曲线.回归得到方程y=ax+b ＠亚硝酸根浓度= ,mg/毫升 d=稀释倍数 

细菌浓度测定  

取0.1毫升培养液加到0.9毫升生理盐水中,混匀,就得到10－1的菌悬液,再取出0.1毫升加到0.9毫升生理盐水中,得到10－2的菌悬液,同样方法依次稀释到10－3,10－4的菌悬液,具体情况视菌悬液浓度而定.  

将稀释好的菌悬液取0.1毫升,与冷却到50摄氏度的琼脂培养基混匀,于24摄氏度培养5天,进行计数.