注:P<0.05。 3、讨论 六味防脱生发酊剂的最初效果表现为固发,即停止脱发或脱发减少,随后出现生发、长发,即先生出毳毛样发,再逐渐变为终毛,或毳毛样发逐渐变黑、粗、硬、长。该药除有固发、生发作用外,对头皮瘙痒、头屑、皮脂过多都有不同程度的治疗作用,使瘙痒消失或减轻,头屑消退或减少。该药能使头部过多的皮脂减少,使部分头部皮脂少而干燥者变柔润。本试验中未发现明显不良反应。 六味防脱生发酊为纯中药制剂,具有养血活血、祛风生法之功。对气血失和、化燥生风而引起的头屑增多,瘙痒症状有一定缓解作用,配合适当的按摩患处以加强毛囊微循环,改善毛发营养,促进毛发生长和药物吸收,有更好的生发固发效果。 为了确保本发明质量检测方法的科学、有效、合理,申请人也对其进行了相关的试验研究: 原防脱生发灵[黔卫药准字(1993)L第29号]的质量检测标准{贵州省卫生厅文件[黔卫药字(93)第476号]}中没有含量测定项目,且未明确处方量及详细制法。本发明六味防脱生发制剂处方中含有的何首乌为方中主药,为更好地控制产品质量,申请人对其含量测定进行了方法学研究。 处方中的何首乌为主要成分,参考《中国药典》2005版何首乌药材检测成分为2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9),选择何首乌所含2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)含量为指标,对本发明制剂中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)的高效液相含量测定方法进行了精密度、稳定性、重现性、回收率试验线性范围等项目的研究,建立了行之有效的含量测定方法,以控制产品质量。 1、仪器与试药 仪器:岛津prominence LC-10Atvp高效液相色谱仪 色谱柱:Hypersil-ODS C18(4.6×150mm) HS10260D超声波清洗机(260W,40KHZ,天津市恒澳科技发展有限公司) AUW120D电子天平(十万分之一,日本岛津公司) 试药:2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100080-200306) 六味防脱生发酊样品及何首乌阴性样品; 一般用乙腈为分析纯,流动相用乙腈为色谱纯,水为超纯水,其它试剂均为分析纯。 2、测定条件的选择 供试品溶液的制备:精密吸取本发明酊剂5ml,置50ml量瓶中,加50%乙醇30ml,密塞,超声提取10min,取出放冷至室温,用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。 3、色谱条件的确定 参照相关资料2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)含量测定项下方法,2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)在320nm处有较大吸收峰,故选择波长320nm作为测定波长。 另对流动相进行研究,用乙腈-水(23∶77)为流动相进行试验,对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)分离效果、理论塔板数都比较好。同时得到流速控制在1.0ml/min时,保留时间、分离度均理想,阴性样品无干扰。 故最终确定色谱条件为:检测波长为320nm;流动相为乙腈-水(23∶77);流速为1.0ml/min。 4、线性关系的考察 精密称取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)对照品25.92mg,置25ml容量瓶中,加50%甲醇溶液溶解,定容至刻度(浓度为1.0368mg/ml)。分别精密吸取1ml、1ml、1ml、3ml、5ml,各置于50ml、25ml、10ml、10ml、10ml容量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,配制成不同浓度溶液,精密吸取上述5份对照品溶液各10μl,按照色谱条件进样,测定峰面积。以对照品浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线,以峰面积对样品浓度(μg/ml)进行线性回归计算。得线性回归方程为:2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9):y=0.0000771X-1.52572058,r=0.9999,由表可知2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)在20.736μg/ml~518.4μg/ml范围内线性关系良好。结果见表2: 表2 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)线性关系 5、精密度试验 取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)对照品溶液(103.68μg/ml)10μl,重复进样5次,测定峰面积,2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)的平均峰面积为1362173;RSD(%)为0.62%。结果见表3: 表3 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)的精密度试验 6、样品提取时间的考察 精密吸取本发明酊剂5ml 4份,置50ml量瓶中,加50%乙醇30ml,密塞,超声处理5分钟、10分钟、15分钟、20分钟,取出放冷至室温,用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取上述供试品液和对照品10μl注入液相色谱仪,测定,即得。结果如下: 表4 超声时间的考察 由结果可知提取时间对含量测定结果影响不大,故选择提取时间为10min。 7、稳定性试验 取本发明酊剂5ml,按含量测定项下供试液的制备方法制备供试液,分别于0、2、4、6、8小时进样,测定2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)峰面积,2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)平均峰面积为187961,RSD为0.487%,说明供试液在8小时内稳定性良好。结果见表5。 表5 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)的稳定性试验 8、重复性试验 按本发明拟定的含量测定方法,取同一批号样品5份,精密量取5ml,按供试品溶液制备和测定项下的方法进行操作,依法测定,结果如表6: 表6 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)的重复性试验 9、回收率试验 精密量取已知含量的本发明酊剂5份,每份3ml,分别精密加入一定量2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)对照品溶液1ml(浓度1.0368mg/ml),按照供试品溶液制备方法处理,即得5份样品溶液。依含量测定项下的方法测定,计算回收率,结果见表7。 表7加样回收率试验 试验表明:平均回收率为101.2%,RSD=1.6%,该方法具有较好的回收率。 实验总结:经对六味防脱生发酊中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)的含量测定实验,表明:在20.736μg/ml~518.4μg/ml范围内线性关系良好,精密度实验平均峰面积为1362173,RSD(%)为0.62%;稳定性试验平均峰面积为187961,RSD为0.487%,说明供试液在8小时内稳定性良好;重复性试验平均含量为0.1432,RSD为0.23%;加样回收率试验平均回收率为100.186%,RSD=0.7197%。因此,该含量测定方法可行。 与现有技术相比,本发明所提供的六味防脱生发制剂具有去屑止痒、防脱生发、乌发护发之功效,临床验证其总有效率达96%;且防治兼顾,安全无毒,是治疗脂溢性脱发理想的纯中药制剂;所述质量检测方法专属性强,精密度高,稳定性好,测量结果准确,可有效控制六味防脱生发制剂的质量,从而确保其临床疗效。 具体实施方式: 以下为实施例: 本发明的实施例1:六味防脱生发酊的制备: 大黄30g、苦参20g、何首乌15g、当归15g、黄芪15g、薄荷5g 取以上六味,粉碎成粗粉,混匀,照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(药典附录I O),用55%乙醇作溶媒,浸渍24小时后,以每分钟2~3ml的速度缓缓渗漉,收集渗漉液1000ml,活性炭吸附,滤过,灌装,包装,即得六味防脱生发酊。其使用方法分为外洗法和外擦法两种。外洗法:洗头后取本制剂20ml,加温水100ml稀释后直接淋在头皮及发部,并轻轻拍打2~3分钟后擦干,不再冲洗;2~3天一次。外擦法:先用热毛巾将局部擦洗干净,然后将药液轻轻涂擦患处,最后用手指在涂药处轻轻叩击5~10分钟,每日1~2次。治疗期间,忌食烟、酒及辛辣物。对酒精过敏者禁用。 本发明的实施例2:六味防脱生发凝胶剂的制备: 取大黄25g、苦参15g、何首乌10g、当归10g、黄芪10g和薄荷3g,粉碎成粗粉,混匀,照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法,用55%乙醇作溶媒,浸渍24小时后,以每分钟2~3ml的速度缓缓渗漉,收集渗漉液,活性炭吸附,浓缩至10g,加入凝胶剂基质(由卡波姆94020g、甘油60g、聚乙二醇4000 20g、无水乙醇220g、三乙醇胺30g和水800g组成;取卡波姆940加适量蒸馏水于研钵中研磨均匀,滴加三乙醇胺调节使成凝胶状,再依次加入聚乙二醇4000、甘油、无水乙醇,研匀即得)940g,搅拌均匀,即得六味防脱生发凝胶剂。该制剂外用,每次取10~30g,涂擦于头皮及发根部,2~3天一次。 本发明的实施例3:六味防脱生发软膏剂的制备: 取大黄35g、苦参25g、何首乌20g、当归20g、黄芪20g和薄荷7g,粉碎成粗粉,混匀,照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法,用55%乙醇作溶媒,浸渍24小时后,以每分钟2~3ml的速度缓缓渗漉,收集渗漉液,活性炭吸附,浓缩至20g,加入冷至室温后的软膏剂基质(由羧甲基纤维素钠150g、甘油100g、尼泊金乙酯2.5g和水1000g组成;取羟甲基纤维素钠置于研钵中,加入甘油研匀,加入水800ml使完全溶解,然后边研边加入溶有尼泊金乙酯的水溶液,研磨均匀,即得)950g,研磨混匀,即得六味防脱生发软膏剂。该制剂外用,每次取10~30g,涂擦于头皮及发根部,2~3天一次。 本发明的实施例4:六味防脱生发软膏剂的制备: 取大黄25g、苦参25g、何首乌10g、当归20g、黄芪10g和薄荷7g,粉碎成粗粉,混匀,照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法,用55%乙醇作溶媒,浸渍24小时后,以每分钟2~3ml的速度缓缓渗漉,收集渗漉液,活性炭吸附,浓缩至15g,加入冷至室温后的软膏剂基质(由硬脂酸14重量份、单硬脂酸甘油酯4重量份、蓖麻油24重量份、甘油12重量份、三乙醇胺2重量份、对羟基苯甲酸乙酯0.24重量份和水8重量份组成;取硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、蓖麻油和对羟基苯甲酸乙酯在50~60℃加热搅拌熔化,得油相基质,另将甘油、三乙醇胺、水在50~60℃加热搅拌熔化,得水相基质,将油相基质缓缓加入水相基质中,并不断搅拌,混匀,即得)920g,研磨混匀,即得六味防脱生发软膏剂。 本发明的实施例5:六味防脱生发搽剂的制备: 取大黄35g、苦参15g、何首乌20g、当归10g、黄芪20g和薄荷3g,粉碎成粗粉,混匀,照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法,用55%乙醇作溶媒,浸渍24小时后,以每分钟2~3ml的速度缓缓渗漉,收集渗漉液,活性炭吸附,浓缩至18g,加入水或甘油或乙醇或植物油980g,混匀,过滤,即得六味防脱生发搽剂。该制剂外用,每次取10~30g,涂擦于头皮及发根部,2~3天一次。 本发明的实施例6:六味防脱生发制剂的质量检测方法包括以下项目: 鉴别:(1)取本制剂20ml,水浴上挥去乙醇,加乙醚提取2次,每次15ml,合并乙醚液,浓缩至1ml作为供试品溶液;另取大黄对照药材0.2g,加乙醚10ml振摇提取20分钟,滤过,滤液挥至约1ml,作为对照药材溶液;再取大黄酸对照品,加乙醚制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典附录VI B薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各5~10μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以正己烷∶乙酸乙酯∶甲酸=30∶10∶0.5为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的一个斑点;置氨蒸气中熏后,斑点变为红色。 (2)取本制剂20ml,水浴上挥干,加25ml氯仿和0.3ml浓氨试液溶解,滤过,滤液挥至1ml,作为供试品溶液;另取苦参碱对照品,加氯仿制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典附录VI B薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液=20∶2.4∶0.8、10℃以下放置的下层溶液为展开剂,置氨蒸气饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液;供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。 含量测定:色谱条件与系统适应性实验 用十八烷基硅胶为填充剂;乙腈∶水=23∶77为流动相;柱温:40℃;检测波长为320nm;理论塔板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000。 对照品溶液的制备 取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量,精密称定,用50%乙醇溶解,制成每1ml约含0.1mg的溶液,摇匀,即得。 供试品溶液的制备 精密量取本制剂5ml,置50ml量瓶中,加50%乙醇30ml,密塞,超声提取10分钟,取出放冷至室温,用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。 测定法 精密吸取上述三种溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。 本制剂每1ml含2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C20H22O9)不得少于0.12mg。 |
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