WB,(Western blotting),中文名蛋白质印迹,又称免疫印迹(immunoblotting),用于检测特异性目的基因表达的蛋白成分。 比如说你要用大肠或者酵母表达某种目的蛋白,把基因克隆到宿主后,要检测的目的蛋白的表达就可以用western blot。 总体来说有5个步骤,蛋白电泳,转膜,封闭,加抗体,以及检测。 1 蛋白电泳—蛋白根据分子量大小分开 SDS(负电)-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 分子量大的跑得慢,在胶的顶部,分子量小的跑得快,在胶的底部(电泳速度与分子量大小、电荷量和蛋白结构有关) 蛋白上样缓冲液: SDS,可使得蛋白裹上足量的负电荷,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷,这样就消除了不同分子间的电荷差异; DTT还原剂,可打开巯基维持单链的线性结构,并且通过煮沸仅保留一级结构,消除了结构差异; 甘油,可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部,不会逸散至加样孔以外; 溴酚蓝,小分子蓝色物质,在最下面的位置,有指示作用:当它刚好跑出最下方玻璃板时,就可以结束电泳了。 2 转膜(膜与蛋白有高度亲和的能力) 因为蛋白位于胶的内部,所以要将蛋白从胶内部转移到膜表面,使抗体更容易和蛋白结合。 常用的两种:NC硝酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜 电场垂直于凝胶和膜:所以凝胶中的蛋白(带负电)向紧贴着凝胶的膜上转移,最终吸附在膜的表面 滤纸:维持transfer buffer稳定流动。 里面会加甲醇:当蛋白从凝胶中出来后,使蛋白与SDS分离,阻止其继续移动,从而更好地与膜结合。 3 封闭 封闭膜的空白结合位点,防止添加的抗体吸附在除目标蛋白外的膜上的其他位置(且很难洗掉),否则最终会显示出非特异性条带、杂带、高背景等,不仅浪费抗体,还影响判断。 脱脂牛奶或BSA胎牛血清。虽然也会在一定程度上吸附到目标蛋白上,但都属于非特异性的结合,很容易在后面的漂洗中消除 4 抗原抗体免疫反应 1)一般先加一抗:与蛋白特异性结合,常用的孵育时间和温度是4℃摇床过夜赋予(温度适宜,分子运动温和)。洗膜:未结合一抗洗掉。 2)二抗:被HRP辣根过氧化物酶标记(可与发光底物相结合)的抗体:可结合多个二抗,放大信号。同样也是孵育后洗膜 5 蛋白检测 资料来源 联系我们 电话:15110423059 |
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