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2023年7月4日广州中山大学附属第三医院神经内科、精神神经疾病研究中心蔡蔚研究团队在Nature communications发表论文“Macrophage lineage cells-derived migrasomes activate complement-dependent blood-brain barrier damage in cerebral amyloid angiopathy mouse model”。揭示了巨噬细胞谱系细胞来源的迁移体在脑淀粉样血管病小鼠模型中激活补体依赖性血脑屏障损伤。
图一 在CAA患者和动物模型中检测到巨噬细胞来源的迁移体 首先采用透射电镜进行分析CAA患者的血管病理改变，观察到迁移体沉积在皮肤血管周围。迁移体为直径为0.5-3.0μm的大椭圆形囊泡，囊泡数量不等。迁移体似乎来源于血管中积累的巨噬细胞。在脑外伤患者中，皮肤水泡中的迁移体不明显。CAA患者的血管壁附着有大量小泡，可能是迁移体释放的。被小泡包围的内皮细胞结构粗糙而模糊，而无小泡附着的内皮细胞外观完整。在CAA患者中，中枢神经系统和外周血均有明显的血管淀粉样变，可以揭示脑血管的病理改变。因此，作者推断巨噬细胞来源的迁移体有助于CAA的脑血管破坏。为进一步观察，收集CAA患者和健康供体血浆中的细胞外囊泡，并在阴性染色后进行透射电镜分析。CAA患者的外周血白细胞显示了迁移体标记物的表达升高，显示了活跃的迁移体生产力。与HC相比，CAA患者的单核细胞中TSPAN4、TSPAN7、TSPAN9和NDST1的表达增加。推断是巨噬细胞谱系细胞导致了CAA中过度迁移体的产生。发现外周血单核细胞的TSPAN4表达与认知功能下降相关和CAA患者的有害磁共振成像指征。小鼠冠状脑切片中Iba1+细胞中TSPAN4的表达与循环F4/80+细胞中呈正相关，然而，Tg-SwDI/B小鼠血浆NeFL的升高与血液中TSPAN4+ F4/80+细胞的增加有关，而不是与大脑中TSPAN4+ Iba1+细胞的增加有关，以上数据表明，来自巨噬细胞谱系细胞的迁移体与CAA的进展有关。
图二 Aβ40的吞噬作用诱导巨噬细胞产生迁移体 作者的数据说明了在CAA患者中Aβ40的增加与巨噬细胞谱系细胞产生额外的迁移体呈正相关。考虑到Aβ40在CAA病理生理学中的关键作用，评估了Aβ40对巨噬细胞谱系细胞迁移体生产力的影响。人外周血单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞用CAA患者的血浆治疗。通过免疫染色，发现CAA血浆引起的收缩纤维。同时，在CAA血浆刺激后，单核细胞和巨噬细胞中TSPAN4的表达增加。用单克隆抗体消融Aβ40消除了CAA等离子体的迁移诱导作用。此外，Aβ40的治疗促进了人单核细胞和巨噬细胞中迁移体的产生，表明Aβ40是巨噬细胞来源的迁移体的一个足够和必要的诱导剂。在体外，小鼠骨髓源性巨噬细胞显示出活跃的迁移体的产生对Aβ40刺激的反应的时间和剂量依赖的方式。Aβ40在小胶质细胞中诱导作用也很明显，在Tg-SwDI/B和5xFAD小鼠的大脑中，Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞，CD206+PVM和F4/80+浸润巨噬细胞的Aβ40吞噬显示出主动产生迁移体。为了追踪巨噬细胞谱系细胞中过度迁移体的起源，在Tg-SwDI/B小鼠中分别消耗了小胶质细胞、PVM或循环单核细胞。Aβ40的脑巨噬细胞谱系细胞，包括小胶质细胞、PVM和单核细胞来源的浸润巨噬细胞，都有助于CAA中过度迁移体的产生。在体外，BMDM在Aβ40刺激前用细胞松弛素D抑制吞噬作用。当没有被BMDM吞噬时，Aβ40的tspan4诱导和迁移体诱导作用被消除。尽管Aβ40的吞噬不受影响，TSPAN4的过表达导致了过度的迁移体的产生，以上结果表明，Aβ40的迁移体诱导作用依赖于巨噬细胞的内化和随后的TSPAN4表达的增加。Aβ40的积累触发了巨噬细胞谱系细胞的吞噬，进而诱导TSPAN4的表达和迁移体的产生。作者还记录了一些促炎介质，包括LPS，TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-17A，轻微上调了BMDM中TSPAN4的表达，但不能诱导额外的迁移体的产生，以上数据表明，在CAA中巨噬细胞面对的刺激因子中，Aβ40是额外迁移体的基本诱导因子。
图三 来自Aβ40刺激的巨噬细胞的迁移体对血管内皮细胞有害 因为巨噬细胞的TSPAN4表达与血浆NeFL水平呈正相关，作者推断巨噬细胞来源的迁移体导致了CAA中血脑屏障的破坏和脑损伤。为了验证这一假设，分离了来自Aβ40刺激的BMDM的迁移体，并分析了其破坏性。通过TEM、均匀直径分析、结构稳定性分析和免疫染色显示，纯化后的囊泡显示出典型的迁移体结构。免疫印迹结果证实了分离的囊泡中迁移体标记物的表达。与未受刺激的BMDM相比，Aβ40处理的BMDM产生的迁移体对内皮细胞有很强的粘附性。在Aβ40-M处理的内皮细胞中，几种caspase信号通路被激活，包括Caspase-3、7、8、9，进一步揭示了Aβ40-M的细胞毒性。同样，Aβ40-M对其他血脑屏障成分有害，在Aβ40-M处理的内皮细胞中，与存活和增殖相关的基因表达下调。在Aβ40-M治疗后，ZO- 1蛋白水平及其在内皮间隔期的连续性降低。将脑血管内皮细胞接种在细胞培养插入物上。在迁移体给药2小时后，Aβ40-M处理的内皮屏障中的TEER降低。用Aβ40刺激的BMDM培养的内皮细胞下调了紧密连接蛋白ZO-1的表达， TSPAN4的表达有效地改善了巨噬细胞的有害影响，而在共培养系统中添加BMDM衍生的Aβ40-M则逆转了对TSPAN4 KD的保护作用，作者发现迁移体的构建对其破坏性作用是不可或缺的。当超声破坏其内在结构时，Aβ40-M对内皮细胞不再具有细胞毒性，与Aβ40-M相比，来自Aβ42处理的BMDM的迁移体显示出类似的粘附性，但结果对内皮细胞无害。
图四 Aβ40刺激下巨噬细胞产生的迁移体直接导致脑血管损伤 接下来，作者研究了来自Aβ40刺激的巨噬细胞的迁移体的致病性。由Aβ40-或pbs处理的Raw264.7细胞产生的迁移体，即Aβ40-M或PBS-M，转移到野生型健康C57/BL6小鼠。第7天，每个受者注射单剂量3kDa的右旋糖酐，用荧光显微镜证实了Aβ40-M与脑血管系统的连接。与体外数据一致，Aβ40-M在体内可引起血脑屏障损伤。受体的脑微血管显示ZO-1表达下降。3kDaD葡聚糖从外周血中渗漏到脑实质和眼球。同时，Aβ40-M转移小鼠的血浆NeFL升高，进一步揭示了迁移体引起的神经轴突变性，以上数据表明，来自Aβ40刺激的巨噬细胞的迁移体对血脑屏障具有破坏性，并可能启动Aβ沉积和脑损伤的自我强化病理。
图五 来自Aβ40刺激的巨噬细胞的迁移体促进了对脑血管的的细胞毒性 为了探讨迁移体诱导的血脑屏障损伤的机制，对PBS-M中鉴定的蛋白进行分析，发现巨噬细胞来源的迁移体的功能在生理环境中与吞噬作用和代谢的调节有关，然而，在Aβ40刺激下，由于多种代谢相关蛋白不再富集，迁移体的生理效应似乎减弱，同时Aβ40-M含有丰富的粘附/细胞-细胞接触相关蛋白。在PBS-M和Aβ40-M中都鉴定出了多个数量相同的线粒体蛋白，表明线粒体成分被包装在巨噬细胞来源的迁移体中。在Aβ40-M中上调的蛋白中发现了几种补体激活相关分子，即CD5L、C反应蛋白、血红蛋白A和血红蛋白B。同时，作者记录了Tg-SwDI/B、5xFAD小鼠以及Aβ40-M的WT受体小鼠血浆C5b-9水平的升高。通过免疫染色，检测到CAA模型和Aβ40-M受体的大脑中C5b-9的沉积。它与迁移体标记物TSPAN4沿着脑血管共定位。血浆C5b-9水平与CAA中单核细胞TSPAN4表达和血浆NeFL浓度呈正相关，表明补体激活、巨噬细胞来源的迁移体和脑损伤之间的关联。通过体外实验发现当胎牛血清中的补体失活时，Aβ40-M对内皮细胞的损伤作用被消除，而在培养系统中补充补体混合物则重新产生了损伤，因此，作者认为巨噬细胞来源的迁移体通过激活CAA中的CDC来损伤血脑屏障
图六 CD5L在Aβ40刺激下通过巨噬细胞来源的迁移体与脑血管连接，对于迁移体介导的血脑屏障损伤是必不可少的 接下来，作者试图揭示迁移治疗型CDC的分子机制。根据ITRAQ的数据，PBS-M和Aβ40-M均含有补体亚型，如C1qa、C1qc、C1ra、C3和C4b。然而，PBS-M和Aβ40-M之间的补体蛋白水平是相当的。因此推断Aβ40-M的有害作用独立于迁移体内补体成分。在验证ITRAQ结果时，Aβ40刺激增加了两种BMDM中CD5L、HBA、HBB和CRP的表达和Aβ40-M，CD5L（巨噬细胞凋亡抑制剂，主要由炎症组织中的巨噬细胞产生）的增量最为显著，促进巨噬细胞存活，加剧炎症反应。CyD抑制Aβ40的吞噬作用或敲除TSPAN4不仅下调了迁移体的产生，而且降低了细胞外囊泡中CD5L的浓度。结果表明，CD5L介导了巨噬细胞来源的迁移体引起的血脑屏障损伤。在机制上，CD5L的损伤作用不依赖于其已建立的受体CD3615，因此证实了CD5L通过激活补体和削弱对CDC的抗性来促进CAA脑血管中的CDC。进一步研究了CD5L在CAA中迁移体介导的CDC中的作用。在CAA患者和小鼠模型中均记录了血浆CD5L的升高。在Tg-SwDI/B和5xFAD小鼠中，观察到CD5L沿脑血管与迁移体和MAC近距离沉积。Aβ40-M中的CD5L防御消除了CDC的启动和血脑屏障损伤效应在体内和体外。这些数据表明，CD5L在CAA中由巨噬细胞来源的迁移小体引起的补体依赖性血脑屏障损伤中是不可或缺的。在CAA患者和小鼠模型中，CD5L通过迁移体与血管壁对接，这将局部CD5L浓度提高到一个损伤水平。Aβ40-M的转移增加了血管中局部CD5L水平，当在细胞中敲除CD5L后，CD5L水平被消除。因此，Aβ40诱导的巨噬细胞来源的迁移体将CD5L连接在血管上，从而促进血脑屏障中的CDC
图七 补体抑制治疗可防止迁移体介导的血脑屏障损伤 补体激活是将血脑屏障损伤与巨噬细胞来源的迁移小体沉积联系在一起的病理链的最终步骤。因此，作者推断补体激活是对抗迁移体介导的血脑屏障损伤的治疗靶点。和在体外内皮屏障模型中，发现补体抑制治疗，包括PMX-53有效消除Aβ40-M的血脑屏障损伤作用。发现PMX-53在体内逆转了Aβ40-M的损伤作用。经PMX-53治疗的WT Aβ40-M受体显示血浆C5b- 9表达下调，保留了血脑屏障的完整性，并改善了白质损失。在Tg-SwDI/B小鼠中，PMX-53下调了血浆Aβ40的浓度可能是通过打破Aβ40沉积和血管损伤的恶性循环。这些数据支持了补体抑制是CAA治疗中的一种很有前途的策略。 总之，本研究阐明了巨噬细胞来源的迁移体在CAA中的有害特性。迁移小体是由遇到淀粉样蛋白刺激的巨噬细胞谱系细胞过度产生的，这进一步促进了补体依赖性的血管损伤。作者认为C5b-9代表了CAA的潜在生物标志物，补体抑制治疗具有治疗潜力。然而，迁移体在各种环境下的生物学和病理作用仍然知之甚少。CD5L如何被分类/转运到迁移体中，以及介导CD5L、迁移体和迁移体受体细胞相互作用的详细分子机制，有待进一步研究。  特别鸣谢 |
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